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《中國農業科技導報》2014年第四期

1高通量測序技術在大豆功能基因組學中的應用

高通量測序技術已廣泛應用于大豆種質資源分析和基因資源挖掘中，涉及的技術領域包括基因組重測序、轉錄組分析、miRNA鑒定等，對深入研究大豆功能基因組學發揮了巨大作用。基因組重測序技術已成為研究大豆基因組遺傳變異規律的有效方法之一。Li等采用該技術對野生大豆和栽培大豆的進化選擇過程進行了研究，結果表明：在從野生大豆向栽培大豆的演變過程中，人工選擇發揮了很大作用，其表現之一是降低了大豆的遺傳多樣性。該研究所提供的基因資源和信息也將促進大豆重要農藝性狀相關的基因挖掘。Wong等利用RNASeq技術對大豆成花誘導過程中葉片和頂端分生組織轉錄組的變化進行了分析，發現生長素、細胞分裂素、赤霉素等植物激素代謝調控途徑與成花啟動具有密切關系。在抗逆性研究方面，Ali等利用Tag測序技術比較了耐鹽型野生材料STGoGS和鹽敏感型栽培品種SSGoGM在鹽脅迫下的轉錄組變化，發現大豆可通過ABA合成、基因轉錄的調控和信號轉導來響應鹽脅迫；Le等通過研究干旱脅迫下大豆葉片轉錄組的變化，發現了大量抗旱相關基因；Vidal等通過比較兩個抗旱性迥異品種的轉錄組，發現了一些抗旱多態性位點。這些研究結果表明，高通量轉錄組分析技術可有效地應用于大豆新基因發現和新分子標記的開發。高通量測序技術的應用還大大加快了miRNA的發現過程。Wang等通過高通量測序詳細地分析了大豆低氮反應中miRNA的相互調控關系。Shamimuzzaman等對大豆種子發育過程中由miRNA介導的剪切降解片段進行深度測序，發現了53個miRNA，并初步確定了其所作用的180個靶基因。隨著測序成本的降低和海量數據處理能力的加強，高通量測序技術將會被更多地應用到大豆基因組學研究中，為大豆新基因的挖掘和分子育種帶來革命性的變革。

2大豆新基因發掘進展

近年來，大豆生長發育分子機制研究取得了顯著成績。Xia等發現E1編碼一個潛在的轉錄因子，其與GmFT2a和GmFT5a的表達呈現拮抗關系，抑制植株開花。Jiang等發現GmFT2a的啟動子區域存在多態性，但這種多態性與生育期多樣性關系不大，認為大豆品種的生育期分化主要與GmFT2a的轉錄調控有關。Na等［12］克隆了大豆中的GmSOC1like基因，基因表達分析和百脈根遺傳轉化實驗證明該基因是大豆中的開花誘導基因。Luo等發現一年生野大豆（Glycinesoja）中的WRKY家族基因GsWRKY20可能通過調節開花相關基因（FLC、FT、SOC1、CO）的表達正向調控開花。Zhao等發現大豆中編碼GAMYB結合蛋白的基因GmGBP1與開花有關。在長日照條件下，該基因在擬南芥中異位表達能夠通過光周期途徑和赤霉素途徑改變CO、FT、LEAFY和GAMYB的表達促進開花，而在短日照條件下，GmGBP1則通過自主途徑改變FLC和SVP的表達進而抑制開花；同時，GmGBP1還能夠增強植株的耐熱性和耐旱性，降低耐鹽性。D1和D2是STAYGREEN（SGR）在大豆中的同源基因，它們的表達促進葉綠素的降解和細胞程序性凋亡相關基因的表達，上述基因的突變是造成大豆成熟時葉片持綠和種皮綠色的原因［15］。Meng等［16］發現大豆中的藍光受體CRY2a能夠與轉錄因子ClB1相互作用抑制衰老相關基因（例如WRKY53b）的表達從而延緩葉片衰老。在結瘤研究方面，Radwan等［17］發現1433蛋白SGF14c和SGF14l在大豆結瘤前期有重要的作用。Qin等［18］分離了一個與根瘤高親和的磷轉運基因GmPT5，其編碼的蛋白能將磷從根的維管束系統運輸到根瘤，尤其是在磷有限的條件下，GmPT5對大豆結瘤和根瘤生長有重要的調控作用。在農藝性狀相關研究方面，Jeong等克隆了大豆葉型和莢粒數控制基因Ln，該基因是擬南芥JAGGED（JAG）的同源基因，參與葉型的控制和果實的發育，與大豆莢粒的形成有關，該研究為大豆高產育種提供了有價值的基因資源。在大豆抗病性研究方面，Liu等和Cook等分別克隆了大豆抗胞囊線蟲基因Rhg4和Rhg1。Rhg4編碼一個絲氨酸羥甲基轉移酶，參與植物體內葉酸的代謝。Rhg1位點由3個抗性相關基因組成，Rhg1基因拷貝數的增加導致基因表達量升高，從而使大豆獲得對胞囊線蟲的抗性。在大豆抗逆性研究方面，Luo等發現來自一年生野大豆的GsWRKY20基因在擬南芥中的異位表達大大增加了植株的抗旱性。Xu等從大豆中分離了12個分子伴侶GmHsp90基因，這些基因在葉片中表達，并且會受到高溫、高滲透壓和鹽脅迫的強烈激活，而對冷脅迫不敏感。此外，研究人員從栽培大豆和野生大豆中分離到的GmDREB2A；2、JAZ家族基因GsJAZ22和GsZFP12基因都與非生物脅迫反應相關。

3大豆分子標記輔助選擇研究進展

近年來，在分子標記的開發和應用方面更加注重利用新的連鎖分析方法挖掘與重要性狀相關的位點，為更好地了解大豆遺傳機制和新基因的克隆奠定基礎。Ha等利用KeunolkongxSinpaldalkong重組自交系研究了種子表皮破裂性狀在4個環境下的QTL及其環境效應。Yang等利用東農594和Charleston雜交形成的重組自交系研究11種環境條件下控制大豆籽粒性狀QTL的加性與上位性作用，確定了主效QTL和不同效應的QTL，為更好地進行標記輔助選擇提供了基礎。以往的研究已定位了多個性狀的QTL位點，但真正應用于育種實踐的卻很少，主要是因為QTL位點定位多采用一個群體，所定位的QTL位點易受遺傳背景影響，所以近年的研究嘗試用多群體、染色體片段置換系（chromosomesegmentsubstitutionlines，CSSL）群體和回交群體等，以期找到不受群體背景影響的位點。Pathan等利用公共親本Magellan分別與PI438489B和PI567516C雜交，構建了包含216和156株系的重組自交系，發現7個與蛋白含量相關的位點、6個與油分含量相關的位點和4個與產量相關的位點，其中位于第6號染色體上的位點還與種子百粒重相關。關聯分析的發展為有效發現、評價和利用分子標記提供了強有力的工具。在開花期相關位點的研究方面，Zuo等利用118個SSR標記來分析了兩年試驗中275個大豆品種的光溫敏感性，得到一系列與光溫反應相關的位點。Niu等利用來自中國6個生態區的257個品種來分析與大豆籽粒形狀相關的性狀，找到了一些有價值的變異位點。Korir等以分別來自中國黃河和長江流域的188個品種和184個KFNo．1xNN11382重組自交系為材料，對大豆的耐鋁性遺傳機制進行研究，用連鎖分析和關聯分析兩種方法共同定位到了11個位點，其中Satt209、Sat＿364、Sat＿240、Sct＿190和Satt284標記在以往的研究中也被證明與耐鋁性相關。兩種方法共同定位的標記很有可能位于耐鋁性基因的候選區域。隨著功能基因的挖掘、分子標記的增加和檢測效率的提高，分子標記輔助育種技術正向自動化方向發展。Song等在測序基礎上發展了含有高密度SNPs的大豆基因芯片SoySNP50KiSelectSNPBeadchip，為分子標記在大豆遺傳多樣性分析和高通量連鎖圖譜構建等方面的應用提供了強有力的工具。目前，基因芯片技術已經應用于大豆抗蚜性，蛋白質和脂肪含量等方面的研究。一些生物技術公司已實現大豆分子標記技術的高度自動化，將其廣泛應用于雜交后代篩選和品種純度檢驗。結合測序的分子標記技術為全基因組功能標記、非功能標記的開發及品種全基因組檔案建立奠定了基礎。

4大豆轉基因育種研究進展

目前，商業化種植的轉基因大豆品種除具有耐除草劑的特性外，還出現疊加高產、優質、抗病等新性狀的材料。過去兩年中，大豆轉基因技術也得到進一步優化，轉化效率不斷提高。

4．1大豆遺傳轉化體系優化根癌農桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）介導的大豆遺傳轉化是大豆轉基因育種中應用最早和最廣泛的方法。該方法對目的基因分子量大小和外植體種類的限制小，導入基因的拷貝數低，外源基因整合完整，遺傳穩定，表達效果好。早在1988年，Hinchee等就用這種方法得到了大豆轉基因植株，證明該方法在大豆遺傳轉化中應用的可行性。然而，由于農桿菌介導法的轉化效率受到農桿菌菌株轉化侵染能力、大豆基因型、組織培養條件、TDNA轉移效率和轉化后篩選模式等因素的影響，目前轉化效率仍然不高。因此，國內外學者一直在進行對該方法的改進和優化工作。Song等從20種中國大豆品種中篩選到了3個轉化效率較穩定的大豆品種粵春045、粵春033和天隆1號。郝榮華等從13個大豆品種中篩選出適合子葉節轉化的山寧14，優化后的轉化效率可到3．2％。蓋江南等［39］利用大豆幼胚進行不定胚誘導進而建立了大豆懸浮培養不定胚繁殖體系用于基因槍轉化。另外，李永光等建立了一種新型農桿菌介導的大豆不定胚原位誘導轉化法，通過去除萌發大豆的頂芽及側芽，輕劃傷口后滴入菌液進行侵染，通過不定芽分化最終得到抗性植株。應用于大豆遺傳轉化體系的傳統篩選劑有卡那霉素、潮霉素和草胺膦等，近期也有一些關于其他篩選劑報道。岳巖磊等和張敏等分別探索了草甘膦和滅草煙的篩選效果，認為這兩種篩選劑也具有較好的應用前景，從而拓寬了篩選劑的選擇空間。

4．2大豆轉基因品種選育轉基因技術在改良大豆品質、耐除草劑、抗病性、抗逆性等方面取得了新的進展。美國孟山都公司推出的高油酸大豆，其油酸含量比目前任何商業化種植的大豆品種都要高。此外，抗麥草畏、高產、抗蟲高產、高Ω3亞麻酸、高γ亞麻酸（GLA）、高油等類型的轉基因品種已經或即將上市。在抗病蟲大豆新材料創制方面，Youssef等發現過表達AtPAD4（PHYTOALEXINDEFICIENT4）的大豆復合體植株對大豆胞囊線蟲（soybeancystnematode，SCN）及根節線蟲（rootknotnematode，RKN）的抗性均有所提高；在導入水楊酸甲基轉移酶基因GmSAMT1的大豆發狀根以及導入大豆胞囊線蟲果糖1，2磷酸酶沉默載體pRAPHgALDRNAi的大豆復合體植株［45］中，SCN的發育受到阻礙；過表達抗蟲基因cryIA的大豆品種東農50對食心蟲的抗性明顯優于對照。在抗逆育種研究方面，轉入水稻脫水應答轉錄因子OsDREB2A和過表達GmNFR5a的轉基因大豆耐鹽性有所提高；轉入煙草滲調蛋白基因Tbosm的大豆植株不僅耐鹽性有所改善，而且對白粉菌、褐紋病菌和大豆銹菌的抗性也有所增強；過表達鹽芥肌醇磷酸激酶基因ThIPK2的大豆在耐旱、耐鹽以及抗氧化能力方面均有所提高。在品質改良方面，Song等將擬南芥胱硫醚γ合成酶基因AtDCGS轉入大豆，提高了籽粒蛋氨酸的含量；Kim等將O乙酰絲氨酸巰解酶基因OASS轉入大豆，提高了籽粒中與蛋白質結合的半胱氨酸和游離半胱氨酸的含量。以上研究為培育抗病、抗逆、優質轉基因大豆品種奠定了基礎。2013年，中國農業部為巴斯夫農化有限公司申請的抗除草劑大豆CV127、孟山都遠東有限公司申請的抗蟲大豆MON87701和抗蟲耐除草劑大豆MON87701×MON89788發放了農業轉基因生物安全證書，允許其進口用作加工原料。其中，CV127已在美國、加拿大、日本、韓國、澳大利亞、新西蘭、菲律賓、墨西哥、哥倫比亞、俄羅斯、南非、巴西和阿根廷等國家獲得批準用于商業化種植或食用；MON87701已在美國、加拿大、日本、歐盟和墨西哥等國家或地區批準用于商業化種植或食用；MON87701×MON89788已在歐盟、韓國、墨西哥、阿根廷、巴西和巴拉圭等國家或批準用于商業化種植或食用。可見，轉基因大豆新品種的商業化種植及應用已成為全球化的發展趨勢，因此提高我國轉基因大豆自主研發能力已刻不容緩［54］。

5展望

2012－2013年，國內外大豆分子育種取得了較大進展，并呈現出新的發展趨勢，今后應更加注重以下領域的研究：高通量測序技術在大豆種質資源分析和基因資源挖掘方面的應用；具有重要利用價值的基因的挖掘；關聯分析方法在基因定位方面的作用；多時期、多環境、多遺傳背景條件下大豆重要性狀QTL的挖掘；復合性狀轉基因大豆品種的培育。與水稻、玉米等作物相比，目前大豆的基因組學研究相對滯后，具有實用價值的分子標記較少，遺傳轉化效率偏低，限制了大豆分子育種工作的發展。今后，需要進一步加強大豆功能基因組學研究，深入解析重要經濟性狀形成的分子機制，挖掘有育種價值的新基因和分子標記，進一步提高大豆分子標記輔助育種的通用性、自動化水平和轉基因育種的效率，實現分子育種與常規育種的有機結合。作為世界上最大的轉基因大豆進口國，我國應該大力加強大豆分子生物學研究，推進生物技術在大豆育種中應用，提高自主研發能力，早日實現生物技術改良品種的生產應用。

作者：曲夢楠蔣炳軍劉薇毛婷婷馬立明林抗雪韓天富單位：東北農業大學農學院中國農業科學院作物科學研究所