視網(wǎng)膜組織病理結(jié)構(gòu)改變范文

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摘要：觀察牛磺酸對N甲基D天冬氨酸(NmethylDaspartate，NMDA)興奮毒性引起的大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)損傷的保護作用。方法在大鼠玻璃體腔內(nèi)每眼注射5μl4mmol/LNMDA造成視網(wǎng)膜興奮毒性損傷模型，20只成年雄性SD大鼠隨機分為4組：正常對照組；NMDA組；NMDA+牛磺酸干預(yù)組(腹腔注射25mg/kg牛磺酸)；磷酸鹽緩沖液(PBS)對照組。玻璃體注射后第4d，測量視網(wǎng)膜總厚度及內(nèi)層厚度并用透射電鏡觀察視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果NMDA使大鼠視網(wǎng)膜總厚度尤其是視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度變薄(P＜0001)，超微結(jié)構(gòu)顯示內(nèi)核層及節(jié)細胞層神經(jīng)元發(fā)生變性改變，25mg/kg牛磺酸干預(yù)可有效保護視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)，削弱NMDA引起的視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)損傷。結(jié)論牛磺酸在體內(nèi)可有效保護NMDA引起的視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)損傷。

關(guān)鍵詞：牛磺酸N甲基D天冬氨酸興奮毒性視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)

興奮性氨基酸(EAA)引起的興奮毒性是糖尿病視網(wǎng)膜病變〔1〕、青光眼、視網(wǎng)膜變性等疾病的視網(wǎng)膜神經(jīng)元損傷及死亡的主要機制之一。體內(nèi)研究表明，視網(wǎng)膜的興奮毒性主要由N甲基D天冬氨酸(NmethylDaspartate,NMDA)受體介導(dǎo)〔2〕。牛磺酸(Taurine)是視網(wǎng)膜含量最豐富的游離氨基酸，近年來發(fā)現(xiàn)，牛磺酸可以保護培養(yǎng)的小腦顆粒細胞對抗興奮毒性損傷〔3〕。本實驗通過在大鼠玻璃體內(nèi)注射NMDA制備視網(wǎng)膜興奮毒性損傷模型，觀察牛磺酸對NMDA誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)損傷的保護作用。

1、材料與方法

1、1實驗動物及視網(wǎng)膜NMDA興奮毒性損傷動物模型的建立成年雄性SpragueDawley大鼠20只，體質(zhì)量200～250g(第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心)，實驗動物質(zhì)量合格證號：SCXK(軍)2002008。大鼠腹腔注射速眠新注射液01ml/100g(長春軍需大學(xué)獸醫(yī)研究所)麻醉，5%托品酰胺散瞳，1%利多卡因進行角膜表面麻醉，用微量注射器從顳上方鞏膜距角膜緣外3mm處進針，見針尖到達玻璃體中后部后，緩慢注入5μl4mmol/L的NMDA〔2〕。潔霉素滴眼預(yù)防感染。眼瞎大鼠棄去。

1、2實驗分組20只大鼠按隨機數(shù)字表法分為4組：(1)正常對照組；(2)NMDA組；(3)NMDA+牛磺酸干預(yù)組；(4)磷酸鹽緩沖液(PBS)對照組；每組5只大鼠。正常對照組不進行任何處理；NMDA組為上述模型組；牛磺酸干預(yù)組于眼內(nèi)注射NMDA前1h及其后每天腹腔注射牛磺酸(25mg/kg〔4〕)，共注射3d；PBS對照組于玻璃體內(nèi)注射5μl01mol/LPBS。玻璃體注射后第4d觀察指標變化。NMDA、牛磺酸(美國Sigma公司)，用無菌01mol/LPBS稀釋。

1、3視網(wǎng)膜組織病理學(xué)觀察及視網(wǎng)膜厚度測量腹腔注射2ml/100g03%戊巴比妥鈉處死大鼠，迅速摘取右眼，去除前節(jié)、晶狀體及玻璃體，將眼杯用10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，經(jīng)視乳頭切片(5μm)，蘇木精伊紅(HE)染色，觀察視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)并照相，LEICAQWIN圖像分析軟件于距視乳頭中心15mm處雙側(cè)測量視網(wǎng)膜全層及視見網(wǎng)膜內(nèi)層(包括內(nèi)核層、內(nèi)網(wǎng)狀層、節(jié)細胞層和神經(jīng)纖維層)厚度，每只眼球取6張切片，每組5只大鼠結(jié)果求平均值。

14視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)觀察按前法處死大鼠，摘取左眼，將眼杯迅速置于4℃預(yù)冷的3%戊二醛固定，常規(guī)1%钅我酸固定，系列丙酮脫水，環(huán)氧樹脂浸透包埋，經(jīng)光鏡定位后行超薄切片，于TENCAI10PHILIPS透射電鏡下觀察視網(wǎng)膜各層細胞的超微結(jié)構(gòu)。

15統(tǒng)計分析采用SPSS統(tǒng)計軟件處理，組間比較用單因素方差分析。

2、結(jié)果

2、1視網(wǎng)膜組織病理結(jié)構(gòu)改變及視網(wǎng)膜厚度測量

表1各組視網(wǎng)膜總厚度及視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度測量結(jié)果

HE染色及視網(wǎng)膜厚度測量結(jié)果顯示，玻璃體內(nèi)注射NMDA后第4d，與未注射眼視網(wǎng)膜相比，視網(wǎng)膜總厚度變薄(P＜0001)，尤以視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度變薄明顯(P＜0001)，節(jié)細胞數(shù)有減少，而視網(wǎng)膜內(nèi)、外段及外核層改變不明顯。牛磺酸干預(yù)使視網(wǎng)膜總厚度(P=0017)及內(nèi)網(wǎng)狀層厚度(P=0001)較模型組增厚，節(jié)細胞的丟失減少。表明牛磺酸干預(yù)可有效保護NMDA興奮毒性對視網(wǎng)膜組織病理結(jié)構(gòu)改變。

2、2玻璃體注射NMDA及牛磺酸干預(yù)對視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)的影響透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，玻璃體注射NMDA后第4d，視網(wǎng)膜內(nèi)核層細胞及節(jié)細胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。鏡下可見，NMDA組：視細胞胞體無明顯病變，色素上皮細胞及盤膜正常，內(nèi)核層神經(jīng)元線粒體中、重度腫脹，嵴消失甚至空泡樣變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴重擴張，節(jié)細胞部分軸突明顯腫脹，視神經(jīng)纖維明顯腫脹甚至解體，整個內(nèi)核層神經(jīng)元及節(jié)細胞表現(xiàn)為變性改變。牛磺酸干預(yù)組：內(nèi)核層細胞有輕度線粒體腫脹及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，節(jié)細胞超微結(jié)構(gòu)正常，僅部分節(jié)細胞見輕度線粒體腫脹和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，視神經(jīng)纖維層軸突腫脹不明顯，牛磺酸組超微結(jié)構(gòu)改變較NMDA組明顯減輕。

3、討論

目前認為EAA引起的興奮毒性是糖尿病視網(wǎng)膜病變、青光眼、視網(wǎng)膜缺氧等的視網(wǎng)膜神經(jīng)元死亡的主要機制之一。研究表明〔2〕，視網(wǎng)膜內(nèi)層神經(jīng)元的興奮毒性損傷主要由對NMDA受體的過度刺激引起，NMDA受體的各亞單位在視網(wǎng)膜主要見于內(nèi)網(wǎng)狀層的突觸后神經(jīng)元，即無足細胞和節(jié)細胞〔5〕。Lam等〔6〕用玻璃體內(nèi)注射NMDA的大鼠模型發(fā)現(xiàn)，注射18h后內(nèi)核層和節(jié)細胞層出現(xiàn)大量細胞凋亡。腹腔注射NMDA受體拮抗劑-MK801能有效預(yù)防NMDA對視網(wǎng)膜細胞的損傷〔7〕。將NMDA受體拮抗劑用于預(yù)防視網(wǎng)膜興奮毒性是一種值得探索的方向，但由于NMDA受體同時介導(dǎo)許多正常的生理功能，其拮抗劑用于人體可能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生多種副作用，使其臨床應(yīng)用受到限制〔8〕。牛磺酸是一種正常存在于人體多種組織的游離氨基酸，目前公認牛磺酸是一個調(diào)節(jié)及降低神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+水平的強有力因子〔9〕。有研究提示，牛磺酸可通過防止或降低谷氨酸誘導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+水平的升高而保護培養(yǎng)的大腦神經(jīng)元〔3〕。我們研究發(fā)現(xiàn)，牛橫酸可保護大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變的組織結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)損傷〔10〕。本實驗發(fā)現(xiàn)，牛磺酸在體內(nèi)可拮抗NMDA興奮毒性對視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)的損傷。由于目前未發(fā)現(xiàn)較高劑量的牛磺酸攝入對人體有負面影響，提示將其用于預(yù)防EAA興奮毒性引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)元損傷可能有較好的臨床應(yīng)用前景。