丹皮酚藥理學實證研究范文

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牡丹皮為毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr·的干燥根皮,其主要生物活性物質為丹皮酚(Paeonia,Pae)〔1〕。Pae藥理活性廣泛,其中樞鎮痛作用與嗎啡相比無耐受性、不被納洛酮影響,其鎮痛作用與腦內單胺類遞質水平密切相關,是一種非麻醉性鎮痛藥,適用于慢性鈍痛〔2,3〕。目前Pae在小鼠體內藥動學研究已有報道,但尚未發現有報道Pae在小鼠組織中分布特點的研究。本實驗采用HPLC法測定給藥后Pae在小鼠血漿及組織中的分布,探討Pae在小鼠體內的藥代動力學特點。

1材料

1·1儀器TLG-16冷凍高速離心機(湘儀集團);Finnpipette移液槍(美國ThermoFisher公司);AE240型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);玻璃勻漿器;美國Agillent1100液相色譜儀系統。

1·2試藥Pae標準品(中國藥品生物制品檢定所,批號:110708-200506);Pae提取物(實驗室自制,純度:95·504%);樂百氏純凈水;甲醇、乙腈為色譜純;CMC-Na、氯仿、鹽酸等為分析純。

1·3動物小鼠體重為20~25g,雌雄各半,南京青龍山動物繁殖廠提供,實驗室飼養3天后實驗。

2方法

2·1實驗溶液的配制

2·1·1標準品溶液的制備:精密稱取Pae標準品10mg,于100mL容量瓶中,用甲醇溶解、混勻,定容至刻度,即得標準品貯備液。分別量取該貯備液1、2、5、10、15、20mL于100mL容量瓶中,甲醇定容至刻度,即得濃度為1·0、2·0、5·0、10·0、15·0、20·0μg·mL-1的標準品系列溶液。

2·1·2Pae混懸液的配制:取適量Pae提取物充分研細,精稱650mg置100mL量瓶中,加0·5%CMC-Na水溶液至刻度、搖勻,即得6·5mg·mL-1Pae混懸液。

2·2血漿樣品及組織樣品的處理方法

2·2·1空白血漿加標準品制備:取一定體積Pae標準品溶液置干燥試管中,氮氣流干,加空白血漿200μL,渦旋2min,加入400μL乙腈沉淀蛋白,渦旋2min,4000r·min-1離心15min,上清液于15000r·min-1離心12min,取上清液20μL進樣分析。

2·2·2血漿樣品制備:取各小鼠給藥后血漿200μL,加入400μL乙腈沉淀蛋白,渦旋2min,4000r·min-1離心15min,上清液于15000r·min-1離心12min,取上清液20μL進樣分析。

2·2·3空白組織勻漿液加標準品制備:取一定體積Pae標準品溶液置干燥試管中,用氮氣吹干,分別加各空白組織勻漿液200μL,渦旋2min,加入400μL乙腈沉淀蛋白,渦旋2min,4000r·min-1離心15min,上清液于15000r·min-1離心12min,取上清液20μL進樣分析。

2·2·4組織勻漿樣品制備:取給藥后小鼠心、肝、脾、肺、腎、小腸上端、結腸勻漿液200μL,分別加400μL乙腈沉淀蛋白,渦旋2min,4000r·min-1離心15min,上清液于15000r·min-1離心12min,取上清液20μL進樣分析。

2·3HPLC方法學考察

2·3·1色譜條件:色譜柱:InertsilODS-SP(4·6×150mm,5μm);流動相:甲醇-水(60∶40);檢測波長:274nm;流速:1·0mL·min-1;柱溫:30℃;進樣量:20μL。

2·3·2檢測方法專屬性考察:分別取標準品溶液、空白血漿樣品、空白血漿加標準品、血漿樣品、空白腎組織樣品、腎組織樣品,按“2·3·1”項色譜條件分析,結果(見圖1)。由色譜圖知此色譜條件下,血漿及各組織中內源性物質對Pae測定無干擾,樣品中Pae得到較好分離,其色譜峰的保留時間與對照品一致。

2·3·3檢測限考察:精密量取1·0μg·mL-1的Pae標準品溶液10μL,置干燥試管中,氮氣吹干。分別加血漿和各組織勻漿液200μL,制成含Pae為0·05μg·mL-1的樣品,同時制備空白血漿樣品和空白組織勻漿樣品,按“2·2”項處理后,各取20μL進行分析,用信噪比法,取峰高為基線噪音3倍時的濃度為最低檢測濃度,得Pae最低檢測濃度為0·05μg·mL-1。2·3·4標準曲線的制備:精密量取各Pae標準品溶液80μL,置干燥試管中,用氮氣流吹干,加空白血漿0·2mL,渦旋2min,制備成0·4、0·8、2·0、4·0、6·0、8·0μg·mL-1的系列空白血漿標準品溶液,按“2·2·2”項方法處理。按“2·3·1”項色譜條件,測定不同濃度樣品中Pae的峰面積。以峰面積(Y)對樣品濃度(X)作線性回歸,得回歸方程為Y=50·245X-25·389,r=0·9995,n=6,表明Pae在0·4~8·0μg·mL-1范圍內線性關系良好。

按照“2·2·3”項辦法處理、制備空白組織勻漿液加標準品,按“2·3·1”項色譜條件,制備Pae在心、肝、脾、肺、腎、小腸、結腸中的標準曲線,分別為:①心Y=38·784X-7·5064,(0·1~4·0μg·mL-1),r=0·9996,n=6;②肝Y=31·09X-2·0028,(0·1~8·0μg·mL-1),r=0·9996,n=6;③脾Y=87·818X-29·116,(0·1~8·0μg·mL-1),r=0·9997,n=6;④肺Y=77·341X+0·8087,(0·1~4·0μg·mL-1)r=0·9997,n=6;⑤腎Y=65·282X-2·7899,(0·1~4·0μg·mL-1)r=0·9995,n=6;⑥小腸Y=69·065X-17·85,(0·1~8·0μg·mL-1),r=0·9999,n=6;⑦結腸Y=27·249X-10·771,(0·1~8·0μg·mL-1)r=0·9999,n=6。

2·3·5精密度試驗:分別精密量取4·0μg·mL-1的血漿標準品溶液20μL,按“2·3·1”項色譜條件,連續進樣分析6次,峰面積的RSD為1·89%(n=6)。

2·3·6穩定性試驗:分別制備濃度為1·0、8·0、16·0μg·mL-1的空白血漿加標準品溶液,按照“2·2·1”的方法處理,-20℃條件下保存,于0、1、2、4、8、12、24h進樣分析,峰面積的RSD為1·67%(n=6)。

2·4動物分組及生物樣品預處理小鼠55只,隨機分為11組,每組5只,給藥前禁食12h,Pae按65mg·kg-1的劑量灌胃給藥,于給藥后3、5、7、10、15、30、45、60、90、150、240min眼球取血約1mL,置肝素抗凝的離心管內,4000r·min-1條件下離心15min,制備血漿樣品,于-20℃冰箱保存。將取血后的小鼠立即處死、解剖,分別取出心、肝、脾、肺、腎、小腸上端、結腸,用生理鹽水洗去表面浮血、濾紙吸干水分后,各組織精密稱重。分別取等量小鼠各組織樣品于干燥的玻璃勻漿器中,加入1·7mL生理鹽水充分研磨,組織勻漿液于4000r·min-1條件下離心15min,上清液置-20℃冰箱保存。

2·5生物樣品HPLC檢測分別取“2·4”項預處理的血漿樣品和組織樣品各200μL,按“2·2”項辦法處理,樣品按“2·3·1”項的色譜條件進樣分析。

3結果

實驗數據以“均數±標準差(X±S)”表示,血藥濃度與時間數據用藥物和統計軟件(DAS1·0)進行房室模型擬合并計算藥動學參數。

3·1小鼠血漿中Pae含量HPLC法測定血漿中Pae濃度,見表1,平均血藥濃度-時間曲線(見圖2)。

3·2小鼠灌胃給藥房室模型判斷及體內藥動學參數將小鼠灌胃后血藥濃度-時間數據用DAS1·0藥動學程序軟件進行處理,經模型擬合,結果既有一室型又有二室型。以AIC(擬合精度判據)最小原則為指標,本實驗最小AIC=12·92,結果顯示:最佳房室模型為一室模型,擬合權重系數W=1,從而確定Pae灌胃給藥后在小鼠體內藥動學過程符合單室模型。

按單室模型,用DAS1·0藥動學程序軟件計算小鼠灌胃給藥的藥動學參數(見表2)。

3·3小鼠組織中Pae的濃度及組織分布情況HPLC法測定給藥后心、肝、脾、肺、腎、小腸上端、結腸勻漿液中Pae含量(見表3)。以Pae在各組織中濃度變化的AUC為依據繪制組織分布曲線(見圖3)。

4結論

4·1小鼠一次性灌胃給藥后,Pae在小鼠體內呈單室模型,其血藥濃度-時間曲線類似于靜脈給藥,即給藥后血藥濃度很快達到峰值。Pae灌胃給藥后1min即可在小鼠血漿中測到原形藥,5·3min血藥濃度達到峰值,表明Pae口服吸收迅速;150min后血藥濃度降至Cmax1/10以下,240min時血藥濃度已接近檢測限,表明Pae在體內清除速率較快。

Pae經灌胃給藥后,在小鼠各組織中的tmax與血藥濃度tmax接近,各組織中藥物濃度達峰后很快下降,表明Pae在組織中分布快,消除也快;Pae在小鼠體內主要分布在肝,其次是脾、小腸上端、腎、結腸、心、肺。

4·2中藥有效成分含量通常較低,進入體內后濃度更低,因此考察不同生物樣品處理方法極為重要。生物樣品處理方法有蛋白沉淀法、液-固相萃取法、化學衍生化法等〔4〕。本實驗采用蛋白沉淀法,對三氯乙酸、甲醇、乙腈、乙醚4種蛋白沉淀劑進行考察,發現乙腈處理時,雜質對Pae測定干擾少,方法簡便、準確,重復性好,可滿足樣品分析要求;實驗對乙腈用量進行考察,發現2倍量時既充分沉淀蛋白,且加入體積少,不影響樣品測定。

4·3口服藥物在設計劑型時要充分考慮到藥物的吸收特性:若藥物主要在胃腸道上、中部吸收,制劑時主要考慮延長藥物在胃腸道上、中部滯留時間;如果藥物在全程都有良好吸收,主要考慮使藥物均勻釋放即可。實驗數據顯示Pae在小鼠胃腸道全程均有良好吸收特性,但其消除相半衰期較短,在給藥后4h,小鼠體內的Pae濃度已接近檢測限。Pae及其復方制劑已有片劑、膠囊、顆粒劑、口服液等多種劑型,服用這些制劑時易出現血藥濃度峰谷現象明顯等問題。將Pae應用于治療胃腸道疾病,尤其是結腸部位疾病時,藥物在消化道上端吸收速度較快,肝分布較多,使得藥物到達結腸局部濃度較低,生物利用度較低,治療效果較差,故用于腸道疾病治療時可以考慮將Pae設計為靶向/緩釋制劑。