城市回用水細胞毒性研討范文

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作者：姜淑卿邸金茹王春花何寧李新劉英華劉克明單位：天津市疾病預防控制中心毒理室

城市典型環境水與居民的生活息息相關，其主要包括飲用水源水、城市回用水、自然水體水及市政景觀水等。伴隨著生產和生活污水廢水的排放，環境水不可避免會受到多種有害物質的污染，對生態環境及人類健康產生直接和間接影響。目前環境致突變物的潛在風險被普遍關注[1]，尤其是水中的有機污染物可導致DNA的損傷，引起DNA突變，若突變未被正常修復，就會產生相應的遺傳效應，從而啟動致癌過程。本研究采集某市典型環境水（飲用水源水、城市回用水、流經河水及公園景觀水水樣）對其中有機提取物的細胞毒性和致突變性進行了初步探討，以期為水環境的治理和水資源的合理利用提供科學依據。

1材料與方法

1.1主要儀器與試劑自動固相萃取儀（美國Zymark），R-200型旋轉蒸發器（瑞士Buchi公司），固相萃取柱（3ml，500mg，英國InternationalSorbentTechnology公司），JJT型生物潔凈工作臺（北京半導體設備一廠），3110型CO2培養箱（美國Thermoforma公司），紫外可見分光光度計（北京通用儀器設備有限公司）。甲醇[分析純，利安隆博華（天津）醫藥化學有限公司]，硫酸（分析純，天津市化學式劑三廠），乙酸乙酯（分析純，天津化學試劑有限公司），無水硫酸鈉（分析純，天津市濱?；S），RPMI1640培養粉（美國Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司），胰蛋白酶（德國BoehringerMannheimGmblt公司），噻唑藍（MTT，美國Sigma公司），二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司），L-谷氨酰胺（美國Sigma公司），混合功能氧化酶S9為多氯聯苯誘導大鼠后制備的肝勻漿。

1.2水樣采集于豐水期采集某市飲用水源水、流經河水、公園景觀水及污水處理廠回用水。

1.3水樣預處理采集水樣后加入1%甲醇溶液抑制微生物生長,加入硫酸調節pH到3左右,0.45μm濾膜過濾水樣。調理后將20L水樣以5ml/min流速萃取水樣。萃取后,萃取柱用空氣干燥10～15min,以除去殘留的水分。吸附在C18柱上的化合物用2.5ml乙酸乙酯淋洗2次。獲取所得萃取物用無水硫酸鈉脫去水分,然后旋轉蒸發濃縮,最后在35℃水浴用弱氮氣進一步濃縮到約1ml。

1.4細胞毒性實驗

1.4.1細胞常規培養CHL細胞由天津藥物研究院提供。該細胞在含1%青鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，于37℃，5％CO2培養箱中培養，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。取增殖旺盛、狀態良好的細胞用于實驗研究。

1.4.2劑量分組將常規培養處于對數生長期的CHL細胞配成濃度為4×104個/ml的細胞懸液,加入96孔培養板中，每孔200μl，24h后分別加入相當于原水1000、500、250、125、62.5、31.2ml/ml6個濃度的水樣提取物，以DMSO為溶劑對照，同時設不加細胞的空白對照組。

1.4.3吸光度值測定染毒培養24h后分別向各孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，繼續培養4h后棄去培養液，每孔加入DMSO150μl終止反應，振蕩5min，用酶標儀在492nm、620nm處測量吸光度(A)值。

1.4.4計算半數抑制濃度（IC50）按以下公式計算細胞存活率：細胞存活率（％）＝A試驗組/A對照組×100％，用細胞存活率對劑量對數作圖法求出IC50。

1.5Ames試驗

1.5.1劑量分組試驗設相當于原水體積2000、1000、500、250ml/皿4個劑量，用DMSO配制，同時設溶劑對照。陽性對照：敵克松（50μg/皿），2-AF（20μg/皿）。

1.5.2試驗菌株TA98、TA100菌種（天津市醫藥研究所提供），經鑒定遺傳特性都符合其規定標準。

1.5.3方法在頂層瓊脂中加入0.1ml試驗菌株增菌液、0.1ml受試物溶液和0.5mlS9混合液（當需要代謝活化時）?；靹蚝蟮谷氲讓优囵B基平板上，每個劑量及對照均做3個平行樣，并重復試驗一次。在37℃培養48h，計數每皿回變菌落數、突變率（MR，受試物回變菌落數與空白對照菌落數比值）；MR≥2，且具有劑量-反應關系者定為陽性。

1.6統計學分析采用Excel2003軟件進行統計學分析。

2結果

2.1細胞毒性實驗結果如表1、表2所示，隨染毒劑量的增加，各種環境水有機提取物均引起CHL細胞存活率的降低。水源水、城市回用水、河水、景觀水細胞毒性的IC50分別為550、90、250、500ml/ml。

2.2Ames實驗結果在無代謝活化系統下，城市回用水在500ml/皿及以上兩菌株回變菌落數均超過自然回變菌落數的2倍（表3）；河水在1000ml/皿(表4)兩菌株回變菌落數為自然回變菌落數的2倍以上,且有劑量-反應關系；景觀水在2000ml/皿（表5）菌株TA98回變菌落數為自然回變菌落數的2倍以上；水源水（表6）未見致突變性。在有代謝活化系統下，城市回用水兩菌株在500ml/皿、河水在1000ml/皿兩菌株回變菌落數為自然回變菌落數的2倍以上,且有劑量-反應關系；水源水及景觀水未見致突變性。

3討論

水體有機物污染嚴重威脅生態壞境和人類的生命安全，由于工農業生產和生活污水的長期排放，地面水常被各種有機物污染，如多環芳烴、多氯聯苯和農藥等。我國經濟快速增長工業化發展以及城市化的進程加劇了江河湖泊的水污染。從對人體健康的危害和生態平衡的破壞性來看，有毒有機污染物在環境中往往具有長效性，不易降解，可通過生物鏈蓄集，且對環境的破壞和人體健康的危害多具不可逆性，對人類健康構成嚴重威脅。

本研究采集某城市典型環境地面水中的城市回用水、河水、景觀水和水源水進行細胞毒性和致突變實驗。結果顯示，隨染毒劑量的增加，各種環境水有機提取物均引起CHL細胞存活率的降低，水源水、城市回用水、河水、景觀水細胞毒性的IC50分別為550、90、250、500ml/ml，說明回用水的細胞毒性最大，河水次之，而水源水和景觀水的細胞毒性最小。Ames實驗發現，在無代謝活化系統下，城市回用水在500ml/皿、河水在1000ml/皿、景觀水在2000ml/皿兩菌株回變菌落數為自然回變菌落數的2倍以上,且有劑量-反應關系。在有代謝活化系統下，城市回用水兩菌株在500ml/皿回變菌落數為自然回變菌落數的2倍以上，且有劑量-反應關系；河水在1000ml/皿兩菌株回變菌落數為自然回變菌落數的2倍以上,且有劑量-反應關系；水源水及景觀水未見致突變性。說明回用水和河水在代謝前后均有致突變性，且作用大小變化不大，河水的致突變性稍弱于回用水，景觀水經代謝活化后致突變性消失，景觀水沒有致突變性。各種水體的致突變性強弱與其細胞毒性排序相近。

近年來，城市排放污水回用的可行性研究得到了世界各國政府及學術界的廣泛關注[2]，其環境致突變物的潛在風險尤其成為關注焦點。本課題組經DNA斷裂試驗證實隨著回用水劑量的增加，對質粒的損傷作用也明顯增加，差別有統計學意義（P<0.05）。基因測序法證實城市回用水有機提取物能誘導人胚肝細胞(L-02細胞)p53基因突變[3,4]，證明T市回用水處理后仍存在致突變物，可能由于工藝流程設計上的原因，城市污水廠處理污水的過程中產生了新的致突變物質，如朱鳳鳴等[5]在對自來水的研究中發現，氯化消毒過程中，可產生致突變物鹵代烴,表現出一定的致突變性。水源水和景觀水雖未見致突變性，但存在一定的細胞毒性，河水的致突變性與回用水相近，說明有污染的可能性，提示相關部門存在管理上的欠缺。

綜上所述，T市回用水、河水和景觀水在一定濃度及條件下有致突作用，為降低其潛在的人類致癌風險，確保城市用水人群的安全性，有必要對致突變物質的種類、復合作用機制及去除方法問題進行更加深入細致的研究。