城市回用水細(xì)胞毒性研討范文

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作者：姜淑卿邸金茹王春花何寧李新劉英華劉克明單位：天津市疾病預(yù)防控制中心毒理室

城市典型環(huán)境水與居民的生活息息相關(guān)，其主要包括飲用水源水、城市回用水、自然水體水及市政景觀水等。伴隨著生產(chǎn)和生活污水廢水的排放，環(huán)境水不可避免會(huì)受到多種有害物質(zhì)的污染，對(duì)生態(tài)環(huán)境及人類健康產(chǎn)生直接和間接影響。目前環(huán)境致突變物的潛在風(fēng)險(xiǎn)被普遍關(guān)注[1]，尤其是水中的有機(jī)污染物可導(dǎo)致DNA的損傷，引起DNA突變，若突變未被正常修復(fù)，就會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的遺傳效應(yīng)，從而啟動(dòng)致癌過程。本研究采集某市典型環(huán)境水（飲用水源水、城市回用水、流經(jīng)河水及公園景觀水水樣）對(duì)其中有機(jī)提取物的細(xì)胞毒性和致突變性進(jìn)行了初步探討，以期為水環(huán)境的治理和水資源的合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要儀器與試劑自動(dòng)固相萃取儀（美國(guó)Zymark），R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（瑞士Buchi公司），固相萃取柱（3ml，500mg，英國(guó)InternationalSorbentTechnology公司），JJT型生物潔凈工作臺(tái)（北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠），3110型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermoforma公司），紫外可見分光光度計(jì)（北京通用儀器設(shè)備有限公司）。甲醇[分析純，利安隆博華（天津）醫(yī)藥化學(xué)有限公司]，硫酸（分析純，天津市化學(xué)式劑三廠），乙酸乙酯（分析純，天津化學(xué)試劑有限公司），無水硫酸鈉（分析純，天津市濱海化工廠），RPMI1640培養(yǎng)粉（美國(guó)Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司），胰蛋白酶（德國(guó)BoehringerMannheimGmblt公司），噻唑藍(lán)（MTT，美國(guó)Sigma公司），二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)Sigma公司），L-谷氨酰胺（美國(guó)Sigma公司），混合功能氧化酶S9為多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)大鼠后制備的肝勻漿。

1.2水樣采集于豐水期采集某市飲用水源水、流經(jīng)河水、公園景觀水及污水處理廠回用水。

1.3水樣預(yù)處理采集水樣后加入1%甲醇溶液抑制微生物生長(zhǎng),加入硫酸調(diào)節(jié)pH到3左右,0.45μm濾膜過濾水樣。調(diào)理后將20L水樣以5ml/min流速萃取水樣。萃取后,萃取柱用空氣干燥10～15min,以除去殘留的水分。吸附在C18柱上的化合物用2.5ml乙酸乙酯淋洗2次。獲取所得萃取物用無水硫酸鈉脫去水分,然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,最后在35℃水浴用弱氮?dú)膺M(jìn)一步濃縮到約1ml。

1.4細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

1.4.1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)CHL細(xì)胞由天津藥物研究院提供。該細(xì)胞在含1%青鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。取增殖旺盛、狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.4.2劑量分組將常規(guī)培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHL細(xì)胞配成濃度為4×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,加入96孔培養(yǎng)板中，每孔200μl，24h后分別加入相當(dāng)于原水1000、500、250、125、62.5、31.2ml/ml6個(gè)濃度的水樣提取物，以DMSO為溶劑對(duì)照，同時(shí)設(shè)不加細(xì)胞的空白對(duì)照組。

1.4.3吸光度值測(cè)定染毒培養(yǎng)24h后分別向各孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO150μl終止反應(yīng)，振蕩5min，用酶標(biāo)儀在492nm、620nm處測(cè)量吸光度(A)值。

1.4.4計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（％）＝A試驗(yàn)組/A對(duì)照組×100％，用細(xì)胞存活率對(duì)劑量對(duì)數(shù)作圖法求出IC50。

1.5Ames試驗(yàn)

1.5.1劑量分組試驗(yàn)設(shè)相當(dāng)于原水體積2000、1000、500、250ml/皿4個(gè)劑量，用DMSO配制，同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照。陽性對(duì)照：敵克松（50μg/皿），2-AF（20μg/皿）。

1.5.2試驗(yàn)菌株TA98、TA100菌種（天津市醫(yī)藥研究所提供），經(jīng)鑒定遺傳特性都符合其規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。

1.5.3方法在頂層瓊脂中加入0.1ml試驗(yàn)菌株增菌液、0.1ml受試物溶液和0.5mlS9混合液（當(dāng)需要代謝活化時(shí)）。混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上，每個(gè)劑量及對(duì)照均做3個(gè)平行樣，并重復(fù)試驗(yàn)一次。在37℃培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)、突變率（MR，受試物回變菌落數(shù)與空白對(duì)照菌落數(shù)比值）；MR≥2，且具有劑量-反應(yīng)關(guān)系者定為陽性。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Excel2003軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1、表2所示，隨染毒劑量的增加，各種環(huán)境水有機(jī)提取物均引起CHL細(xì)胞存活率的降低。水源水、城市回用水、河水、景觀水細(xì)胞毒性的IC50分別為550、90、250、500ml/ml。

2.2Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果在無代謝活化系統(tǒng)下，城市回用水在500ml/皿及以上兩菌株回變菌落數(shù)均超過自然回變菌落數(shù)的2倍（表3）；河水在1000ml/皿(表4)兩菌株回變菌落數(shù)為自然回變菌落數(shù)的2倍以上,且有劑量-反應(yīng)關(guān)系；景觀水在2000ml/皿（表5）菌株TA98回變菌落數(shù)為自然回變菌落數(shù)的2倍以上；水源水（表6）未見致突變性。在有代謝活化系統(tǒng)下，城市回用水兩菌株在500ml/皿、河水在1000ml/皿兩菌株回變菌落數(shù)為自然回變菌落數(shù)的2倍以上,且有劑量-反應(yīng)關(guān)系；水源水及景觀水未見致突變性。

3討論

水體有機(jī)物污染嚴(yán)重威脅生態(tài)壞境和人類的生命安全，由于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生活污水的長(zhǎng)期排放，地面水常被各種有機(jī)物污染，如多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯和農(nóng)藥等。我國(guó)經(jīng)濟(jì)快速增長(zhǎng)工業(yè)化發(fā)展以及城市化的進(jìn)程加劇了江河湖泊的水污染。從對(duì)人體健康的危害和生態(tài)平衡的破壞性來看，有毒有機(jī)污染物在環(huán)境中往往具有長(zhǎng)效性，不易降解，可通過生物鏈蓄集，且對(duì)環(huán)境的破壞和人體健康的危害多具不可逆性，對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

本研究采集某城市典型環(huán)境地面水中的城市回用水、河水、景觀水和水源水進(jìn)行細(xì)胞毒性和致突變實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，隨染毒劑量的增加，各種環(huán)境水有機(jī)提取物均引起CHL細(xì)胞存活率的降低，水源水、城市回用水、河水、景觀水細(xì)胞毒性的IC50分別為550、90、250、500ml/ml，說明回用水的細(xì)胞毒性最大，河水次之，而水源水和景觀水的細(xì)胞毒性最小。Ames實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在無代謝活化系統(tǒng)下，城市回用水在500ml/皿、河水在1000ml/皿、景觀水在2000ml/皿兩菌株回變菌落數(shù)為自然回變菌落數(shù)的2倍以上,且有劑量-反應(yīng)關(guān)系。在有代謝活化系統(tǒng)下，城市回用水兩菌株在500ml/皿回變菌落數(shù)為自然回變菌落數(shù)的2倍以上，且有劑量-反應(yīng)關(guān)系；河水在1000ml/皿兩菌株回變菌落數(shù)為自然回變菌落數(shù)的2倍以上,且有劑量-反應(yīng)關(guān)系；水源水及景觀水未見致突變性。說明回用水和河水在代謝前后均有致突變性，且作用大小變化不大，河水的致突變性稍弱于回用水，景觀水經(jīng)代謝活化后致突變性消失，景觀水沒有致突變性。各種水體的致突變性強(qiáng)弱與其細(xì)胞毒性排序相近。

近年來，城市排放污水回用的可行性研究得到了世界各國(guó)政府及學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注[2]，其環(huán)境致突變物的潛在風(fēng)險(xiǎn)尤其成為關(guān)注焦點(diǎn)。本課題組經(jīng)DNA斷裂試驗(yàn)證實(shí)隨著回用水劑量的增加，對(duì)質(zhì)粒的損傷作用也明顯增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。基因測(cè)序法證實(shí)城市回用水有機(jī)提取物能誘導(dǎo)人胚肝細(xì)胞(L-02細(xì)胞)p53基因突變[3,4]，證明T市回用水處理后仍存在致突變物，可能由于工藝流程設(shè)計(jì)上的原因，城市污水廠處理污水的過程中產(chǎn)生了新的致突變物質(zhì)，如朱鳳鳴等[5]在對(duì)自來水的研究中發(fā)現(xiàn)，氯化消毒過程中，可產(chǎn)生致突變物鹵代烴,表現(xiàn)出一定的致突變性。水源水和景觀水雖未見致突變性，但存在一定的細(xì)胞毒性，河水的致突變性與回用水相近，說明有污染的可能性，提示相關(guān)部門存在管理上的欠缺。

綜上所述，T市回用水、河水和景觀水在一定濃度及條件下有致突作用，為降低其潛在的人類致癌風(fēng)險(xiǎn)，確保城市用水人群的安全性，有必要對(duì)致突變物質(zhì)的種類、復(fù)合作用機(jī)制及去除方法問題進(jìn)行更加深入細(xì)致的研究。