葡萄糖對卵巢癌細胞生長增殖影響范文

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【摘要】目的葡萄糖是維持腫瘤細胞存活的重要能量來源，有關研究表明低糖與無糖條件有可能抑制腫瘤細胞生長，成為潛在的腫瘤治療方式。本研究通過給予不同濃度葡萄糖刺激SKOV3與A2780卵巢癌細胞系，分析其細胞增殖、細胞周期與細胞凋亡的改變，探討葡萄糖對卵巢癌細胞生長增殖的影響。方法在體外配制含不同葡萄糖濃度（0、2．5、5．5、25．0mmol／L）的培養基，分別模擬無糖、低血糖、正常血糖及高血糖水平的體內環境，觀察不同葡萄糖濃度對卵巢癌細胞的增殖、凋亡與細胞周期的影響。結果高糖促進卵巢癌細胞SKOV3和A2780的增殖，干預48h后，增殖幅度約為無糖組的1．841～1．942倍；低糖與無糖條件誘導卵巢癌細胞發生G1期阻滯，與高糖組相比，SKOV3細胞G1期比例以（40．699±1．131）％增加至（58．619±2．643）％，A2780細胞以（46．348±2．150）％增加至（54．770±2．475）％；低糖與無糖條件亦誘導細胞凋亡，SKOV3與A2780細胞無糖組中凋亡細胞比例分別為（14．015±0．827）％和（12．930±1．127）％。結論本研究通過探討葡萄糖對卵巢癌細胞生長與增殖的影響，證明低糖與無糖條件誘導卵巢癌細胞發生G1期阻滯、細胞凋亡并抑制其生長增殖。若進一步給予相應葡萄糖抑制劑干預，可能為卵巢癌的臨床治療提供新思路。

【關鍵詞】卵巢癌；葡萄糖；細胞增殖；細胞周期；細胞凋亡

目前，卵巢癌是婦科惡性腫瘤中引發患者死亡的主要原因［1］，約75％的卵巢癌患者在確診時已處于疾病晚期階段，該類患者在確診時多已伴有腫瘤局部侵犯或遠處轉移等癥狀，常侵及子宮、肝臟、胸膜等器官，伴淋巴結轉移。卵巢癌的基本治療方案通常包括分期手術或腫瘤減滅術，以及聯合鉑類藥物與紫杉醇的新輔助化療［2－3］。盡管該一線治療方案在短期內治療效果尚可、可獲得較高反應率，但大多數卵巢癌Ⅲ期或Ⅳ期患者經治療后對化療藥物易產生抗藥性，其5年生存率＜40％［4－5］。因此，急需新的治療手段來改善卵巢癌患者的生存及預后情況。流行病學數據顯示，2型糖尿病患者患卵巢癌的風險增加［6］。此外，患有糖尿病的卵巢癌患者已被證實具有較低的存活率。另有研究證實，代表卵巢癌發生發展的早期（良性），中期及晚期（攻擊性與侵襲性）階段的小鼠卵巢表面的上皮細胞顯示越來越多的糖酵解表型。該表型證實了卵巢癌的發生發展與糖酵解途徑存在相關關系［7－8］。基于葡萄糖在卵巢癌細胞生長中的作用仍然知之甚少，本研究旨在測試葡萄糖對卵巢癌細胞的細胞生長增殖的影響。

1材料與方法

1．1細胞系

人卵巢癌細胞系SKOV3與A2780均由山東大學附屬山東省腫瘤醫院基礎實驗室提供。

1．2主要試劑與儀器RPMI

1640、DMEM／F12培養基以及胎牛血清（fetalbovineserum，FBS）均購自美國Gibco公司，四甲基偶氮唑藍（methylthiazolyltetrazolium，MTT）、N，N，N′，N′－四甲基乙二胺（N，N，N′，N′－Tetrameth－ylethylenediamine）購自美國Sigma公司，二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）購自中國碧云天公司，AnnexinⅤ／FITC細胞凋亡試劑盒購自美國BD公司。SpectraMaxi3型熒光酶標儀購自德國MolecularDevices公司，FACSCalibur型流式分析儀購自美國BD公司。

1．3方法

1．3．1實驗分組

根據參考文獻［9］及預實驗，選定0、2．5、5．5和25．0mmol／L葡萄糖濃度進行分組，分別代表無糖、低血糖、正常血糖濃度及高血糖濃度的環境。

1．3．2人卵巢癌細胞的培養

A2780細胞與SK－OV3細胞分別選用含質量分數為10％FBS的RPMI1640與含質量分數為10％FBS的DMEM／F12培養基進行培養；培養基中加入質量分數為1％的抗生素。將細胞轉至37℃、5％CO2的培養箱內進行培育。

1．3．3MTT法細胞增殖檢測

分別選取生長狀態良好的SKOV3和A2780細胞制成單細胞懸液，根據細胞特性不同，將每種細胞約4000個／孔接種在含有其相應培養基的96孔板中。24h后，將細胞在對應不同刺激條件的培養基中繼續培養48h。加入5μL／孔MTT溶液（5mg／mL），繼續培養1h后吸走孔內液體，向每孔加入100μLDMSO終止MTT反應。最終通過測定在570nm波長下吸光度值檢測細胞活性。每個試驗依據上述步驟至少重復3次。

1．3．4PI染色法檢測細胞周期

使用碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染色法評估各組葡萄糖對SK－OV3與A2780細胞周期的作用，由20μg／mLPI＋200μg／mLRNaseA＋0．1％TritonX－100配制。以1．0×106mL－1鋪種到培養皿，過夜待細胞貼壁后，更換各組培養基。胰酶消化后使用冷PBS洗滌1～2次。室溫下1200r／min離心5min（r＝11．5cm），去除上層的液體，加入預冷的體積分數為70％乙醇5mL懸浮固定細胞，密封，4℃放置24～72h。固定后室溫下1200r／min離心5min（r＝11．5cm），去除上層液體。使用1mL預冷磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline，PBS）洗滌2遍后1200r／min離心5min（r＝11．5cm）并去除上清，加入一定量的PI（200～400μL）染液。使用流式細胞分析儀評估處于各個周期階段的細胞數。本試驗依照上述步驟至少重復3次。

1．3．5細胞凋亡檢測

使用AnnexinⅤFITC試劑盒檢測AnnexinⅤ的表達。將細胞以1．0×106mL－1接種在培養皿中過夜培養，在上述糖濃度下培養24h。收集細胞后用PBS洗滌，將細胞置于避光條件下置于含有AnnexinⅤ與PI雙染色溶液（0．1μgAnnexinⅤFITC＋1μgPI）的100μLbinding懸浮15min，并最終通過流式細胞儀檢測。本試驗依照上述步驟至少重復3次。

1．4統計學方法

利用GraphpadPrism6．0對所有據進行統計的分析，計量資料以x－±s表示，組間比較采用t檢驗。當比較兩組之間的均數差異時，使用t檢驗，當≥3個樣本時，使用方差分析。檢驗水準α＝0．05。

2結果

2．1高糖促進卵巢癌細胞的增殖

根據上述糖濃度培養卵巢癌細胞48h，通過MTT檢測發現，隨著葡萄糖濃度增加，細胞增殖的相對百分比升高。SKOV3細胞高糖組較無糖組細胞增殖約（1．942±0．086）倍，t＝20．77，P＝0．0002；與低糖組比較，細胞增殖幅度自（1．161±0．117）倍變為（1．942±0．086）倍，t＝7．949，P＝0．004；A2780細胞高糖組與無糖組相比，增殖約（1．841±0．157）倍，差異均有統計學意義（t＝4．193，P＝0．002），說明低糖條件抑制卵巢癌細胞生長，高糖條件促進卵巢癌細胞生長。

2．2低糖誘導卵巢癌細胞G1阻滯

使用不同葡萄糖濃度培養細胞24h之后，與高糖組相比，低糖組細胞處于G0／G1期的百分比相對增多，隨著糖濃度減低，SKOV3細胞處于G0／G1的百分比依次為（40．699±1．131）％、（43．243±1．577）％、（44．846±1．768）％和（58．169±2．643）％，A2780細胞分別為（46．348±2．150）％、（50．875±8．598）％、（52．911±6．793）％和（54．770±2．475）％。SKOV3與A2780卵巢癌細胞高糖組（t＝8．888，P＝0．012）與無糖組（t＝5．358，P＝0．031）比較，差異均有統計學意義。2．3低糖誘導卵巢癌細胞的凋亡圖3示，采用AnnexinⅤ／PI法評估細胞凋亡數目，將細胞在上述糖濃度中培養24h，高糖組、正常糖組、低糖組與無糖組中，SKOV3細胞發生凋亡的比例依次為（3．980±0．962）％、（6．618±0．632）％、（11．000±0．778）％和（14．015±0．827）％。低糖組與正常糖組相比差異有統計學意義，t＝7．013，P＝0．006；低糖組與高糖組比較，差異有統計學意義，t＝8．027，P＝0．015。A2780細胞中發生凋亡的細胞比例依次為（3．745±0．686）％、（4．490±0．198）％、（5．538±0．921）％和（12．930±1．127）％，無糖組與高糖組相比差異有統計學意義，t＝8．984，P＝0．012。

3討論

正常細胞癌變時，其葡萄糖代謝將從氧化磷酸化狀態轉化為有氧糖酵解。腫瘤細胞通過新陳代謝提供其生長與分裂所需的生物合成，并且維持其自身于較低水平的氧化（還原）穩態。即使處于豐富的氧含量條件中，其能量產生優先依賴于糖酵解。雖然糖酵解途徑中的三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）的凈產率不及氧化磷酸化途徑，但是腫瘤細胞通過提高葡萄糖攝取率這一特點，反過來促進更高速率的糖酵解效應進行［10］。因此，腫瘤細胞具有更高的能量消耗比率，其生長與合成對葡萄糖呈高度依賴性。本研究結果顯示，給予不同葡萄糖濃度培養48h后，隨著糖濃度增高，SKOV3與A2780卵巢癌細胞增殖為1．841～1．942倍，表明高葡萄糖濃度通過促進癌細胞產生ATP及其他生物前體的合成，為癌細胞生長提供足夠的能量，從而快速促進卵巢癌細胞增殖。

在低糖與無糖條件刺激下，大多數腫瘤細胞通過誘導凋亡、應激以及細胞周期阻滯，最終導致細胞死亡［11－12］。為進一步探討低糖與無糖條件對卵巢癌細胞周期的影響，本研究通過體外設立4組葡萄糖濃度，模擬人體不同生理狀態的血糖水平［9］，結果顯示，通過對SKOV3與A2780卵巢癌細胞進行上述干預后，癌細胞發生G1期阻滯，阻礙了針對其細胞分裂所進行的生物合成，如RNA、蛋白質及其他生物前體，從而抑制細胞分裂、增殖。AnnexinⅤ作為一種磷脂結合蛋白，其通過磷脂酰絲氨酸與早期凋亡細胞的胞膜結合，故常作為檢測早期凋亡細胞的靈敏指標。

本研究中，在低糖或無糖條件刺激下，卵巢癌細胞凋亡比例為5．538％～14．015％，高糖組細胞凋亡比例為3．745％～3．980％，表明葡萄糖減低時，可能通過阻斷糖酵解導致ATP能量缺失而引發線粒體損傷，線粒體內、外膜之間的通透性轉換孔開放，釋放細胞凋亡啟動因子，引發細胞凋亡。由此可以認為，低糖或無糖刺激抑制卵巢癌細胞增殖，可歸因于誘導其細胞周期G1期阻滯并卵巢癌細胞凋亡。綜上所述，本研究通過探討葡萄糖對卵巢癌細胞生長與增殖的影響，證明低糖與無糖條件誘導細胞發生G1期阻滯、細胞凋亡并抑制其增殖。因此，若進一步給予相應抑制劑干預，有可能為卵巢癌的臨床治療提供新思路，這需要更深入的研究。

參考文獻：

［12］謝澤君，唐玥，周靜，等．二甲雙胍聯合2－脫氧－D－葡萄糖對肝癌細胞增殖與凋亡的影響及其機制［J］．國際腫瘤學雜志，2017，44（2）：81－84．

作者：尹雅潔1，2;盛修貴2，3;王興武2，4;高楠1，2;王菲1，2;鄧祥云1，2 單位：1．濟南大學•山東省醫學科學院.醫學與生命科學學院，2.山東大學附屬山東省腫瘤醫院婦瘤科，3．中國醫學科學院腫瘤醫院深圳醫院婦瘤科，4．山東大學附屬山東省腫瘤醫院基礎實驗室