卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲探討范文

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1材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)材料人卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞ES-2購自上海中科院。pEGFP-C3-4．1N質(zhì)粒和pEGFP-C3質(zhì)粒由美國紐約血液中心Dr．XiuliAn惠贈(zèng)。McCoy＇s5A培養(yǎng)基購自茂健聯(lián)星公司。FBS購自北京元亨金馬公司。Trizol、轉(zhuǎn)染試劑Li-pofectamine2000購自美國Invitrogen公司。G418購自美國默克公司。枸櫞酸抗原修復(fù)液、異丙醇、無水乙醇等購自鼎國生物公司。免疫組化二抗及DAB顯色試劑盒購自美國Dako公司。Transwell小室購自Corning公司。Matrigel膠購自美國BD公司。RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、蛋白BCA定量檢測(cè)試劑盒、ECL發(fā)光液均購自普利來公司。人4．1N兔多克隆抗體由美國紐約血液中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。抗β-actin鼠單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔(鼠)IgG二抗購自中杉金橋公司。Vimentin、E-Cadherin、N-Cadherin、Twist、Slug抗體購自美國Epitomics公司。FastQuantRTKit和SuperRealPreMixPlus均購自天根生物公司。

1．2方法

1．2．1免疫組化選取卵巢子宮內(nèi)膜異位組織標(biāo)本25例和卵巢透明細(xì)胞癌29例。切片常規(guī)脫蠟、抗原修復(fù)，3%雙氧水孵育，滴加兔抗人4．1N抗體，4℃過夜后TBS沖洗，滴加二抗，37℃孵育30min。TBS沖洗，DAB顯色。蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察照相。4．1N免疫組化染色陽性結(jié)果為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒或染色。切片均由2名有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師采用雙盲法評(píng)估算分。結(jié)果判定:采用半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，在高倍鏡下與周圍間質(zhì)相比，無著色記為0分，淺褐色記為1分，褐色記為2分，深褐色記為3分;陽性細(xì)胞百分率＜10%記1分，10%～80%記2分，＞80%記3分。兩者相乘為綜合染色強(qiáng)度評(píng)分。0～2分為表達(dá)缺失，3～6分為表達(dá)降低，9分為表達(dá)正常。

1．2．2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞株ES-2常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的McCoy＇s5A培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育。待貼壁生長(zhǎng)24h、細(xì)胞融合度約90%時(shí)胰酶消化，按1×105細(xì)胞/ml重新接種至6孔板，培養(yǎng)18～24h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000將pEGFP-C3-4．1N質(zhì)粒(4．1N組)和pEGFP-C3質(zhì)粒(Con-trol組)分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6h后，更換新培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24h后加適當(dāng)濃度G418篩選，7～10天后，半量G418篩選濃度維持培養(yǎng)，最終得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。以Westernblot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1．2．3劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的遷移能力穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)約24h。用10μl槍頭在6孔板底部輕劃形成劃痕，PBS洗去漂浮細(xì)胞并換成無血清培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。0、6、24h觀察拍照。用Image-J軟件隨機(jī)量取各圖的劃痕寬度3次，并計(jì)算遷移率:(0h劃痕寬度－6h/24h劃痕寬度)/0h劃痕寬度。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．2．4Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)將基質(zhì)膠用無血清的DMEM培養(yǎng)基1∶8稀釋，加Transwell小室濾膜內(nèi)表面，20μl/室，37℃放置1h。將密度為5×104的細(xì)胞懸液200μl加至transwell上室，下室加600μl完全培養(yǎng)基。5%CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育24h后取出。PBS沖洗膜，用棉簽將微孔膜上層的細(xì)胞擦去，下室用4%多聚甲醛固定10min，HE染色，鏡下隨機(jī)取6個(gè)不同視野計(jì)數(shù)移至微孔膜下層的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．2．5qRT-PCR檢測(cè)4．1N、Claudin4、ZO-1、Twist、Slug、ZEB-2、MMP-2和MMP-3mRNA表達(dá)水平TRIzol提取細(xì)胞總RNA，按FastQuantRTKit說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列見表1。qRT-PCR反應(yīng)按SuperRealPreMixPlus試劑盒說明配置體系并在iQ5Real-TimePCRDetectionSystem上運(yùn)行。結(jié)果分析采用2－ΔΔCT方法，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．2．6Westernblot法檢測(cè)4．1N、E-cadherin、N-cadherin、Vi-mentin和Twist蛋白的表達(dá)RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算上樣體積。根據(jù)目的蛋白的分子量選擇合適濃度的凝膠進(jìn)行電泳。上樣于10%SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，封閉2h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3遍，加相應(yīng)二抗，室溫孵育1h后TBST洗膜3遍，利用BioRadimagingsystem采用ECL發(fā)光顯影。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。采用GraphPadprism5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖分析。采用Fisher精確檢驗(yàn)，Wilcox-on秩和檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．14．1N蛋白在卵巢透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)下調(diào)免疫組化結(jié)果顯示，與異位子宮內(nèi)膜相比，4．1N在卵巢透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)顯著降低(12．96%vs46．30%，P＜0．0001)，見圖1。Westernblot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后，4．1N組中4．1N蛋白和mRNA水平較對(duì)照組顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．0001)。

2．24．1N負(fù)性調(diào)控卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力與對(duì)照組(Control)相比，4．1N組癌細(xì)胞的水平遷移能力在劃痕6h及12h均明顯降低(P＜0．01)，癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力均明顯受到抑制，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(遷移細(xì)胞數(shù):(7．88±0．58)細(xì)胞/視野vs(16．75±1．19)細(xì)胞/視野，P＜0．0001，侵襲細(xì)胞數(shù):(3．50±0．50)細(xì)胞/視野vs(6．25±0．67)細(xì)胞/視野，P=0．004)。見圖3、4。

2．34．1N對(duì)部分緊密連接蛋白、EMT轉(zhuǎn)錄因子和MMPs表達(dá)水平具有調(diào)控作用qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，4．1N組中緊密連接蛋白Clau-din-4(P=0．0013)和ZO-1(P=0．0015)的mRNA水平明顯上調(diào)，分別是對(duì)照組的2．36±0．05倍和18．75±0．68倍，Twist、Slug、ZEB-2mRNA、MMP-2和MMP-3mRNA明顯下調(diào)，分別是對(duì)照組0．53±0．04、0．37±0．00、0．45±0．06、0．68±0．06和0．71±0．11。Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，4．1N組中Twist蛋白明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。見圖4。

3討論

本研究首次發(fā)現(xiàn)，4．1N蛋白在卵巢透明細(xì)胞癌中存在顯著性表達(dá)缺失，并能抑制透明細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力。卵巢透明細(xì)胞癌易復(fù)發(fā)、出現(xiàn)化療耐藥及腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者治療效果不佳和高死亡率的主要原因之一。Kur-man等［9］結(jié)合分子遺傳學(xué)和病理組織形態(tài)學(xué)，提出了卵巢癌細(xì)胞起源的新觀點(diǎn)，認(rèn)為絕大多數(shù)看起來原發(fā)于卵巢的癌實(shí)際上起源于卵巢外組織，卵巢只是繼發(fā)受累部位;并且隨著組織學(xué)類型的不同，腫瘤細(xì)胞的起源與發(fā)病機(jī)制亦不相同，即卵巢腫瘤的發(fā)生存在異質(zhì)性。近年研究表明，卵巢透明細(xì)胞癌與子宮內(nèi)膜異位病灶密切相關(guān)，且越來越多的證據(jù)支持絕大部分子宮內(nèi)膜異位癥是由經(jīng)血倒流而產(chǎn)生的。我們有理由認(rèn)為，透明細(xì)胞癌來源于子宮內(nèi)膜(苗勒氏源性)并種植于卵巢，卵巢是繼發(fā)受累的［11］。此外，在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜中，發(fā)現(xiàn)了包括癌基因通路激活等內(nèi)在的分子異常，這些變化都使得子宮內(nèi)膜組織得以種植播散到腹腔、卵巢表面成為可能。這也是我們實(shí)驗(yàn)選取異位子宮內(nèi)膜組織而沒有選取正常卵巢上皮的原因。相較于異位子宮內(nèi)膜組織，卵巢透明細(xì)胞癌組織中4．1N的缺失說明了4．1N的潛在的抑癌作用。本研究利用細(xì)胞及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段首次發(fā)現(xiàn)，在卵巢透明細(xì)胞癌的演進(jìn)中，尤其是腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲過程中，4．1N可能扮演著重要的負(fù)性調(diào)控角色。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜過程，往往需破壞細(xì)胞間連接、增強(qiáng)游走能力等。緊密連接位于上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞連接處，處于連接復(fù)合體的最頂端，在保持細(xì)胞極性以及協(xié)助信號(hào)傳導(dǎo)等過程中發(fā)揮重要作用，其組成包括Claudins、Occludins及ZO蛋白等。這些蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的具體作用環(huán)節(jié)還有爭(zhēng)議，但緊密連接完整性的破壞可能是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移的原因之一。Shang等發(fā)現(xiàn)，Clau-din-3和Claudin-4表達(dá)缺失的EOC病例往往預(yù)后不良。本研究結(jié)果顯示，4．1N可上調(diào)Claudin-4和ZO-1表達(dá)，從而至少部分解釋了生物學(xué)行為實(shí)驗(yàn)中4．1N對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的抑制作用。腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，涉及多種機(jī)制，包括EMT、失巢凋亡抵抗等。EMT能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，與患者的不良預(yù)后、化療耐藥及靶向治療耐藥均相關(guān)。除經(jīng)典的cadherin-switch(即E-cadherin下調(diào)和N-cadherin上調(diào))現(xiàn)象外，相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Twist、Slug及ZEB-2等也會(huì)被激活。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在ES-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染4．1N后，E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白表達(dá)量都沒有出現(xiàn)明顯改變。本實(shí)驗(yàn)雖未出現(xiàn)cad-herin-switch，但結(jié)果提示4．1N可能通過抑制Twist、Slug及ZEB-2表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)下游分子從而發(fā)揮抑癌作用。Twist已被證實(shí)在很多腫瘤發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用，如抑制E-cadherin的表達(dá)和下調(diào)Claudin-4。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4．1N過表達(dá)導(dǎo)致了Twist下調(diào)和Claudin-4上調(diào)，后者既可能是4．1N的直接調(diào)控結(jié)果，也可能是抑制Twist表達(dá)后的繼發(fā)改變。2013年GilMor研究小組發(fā)現(xiàn)，Twist1在EOC干細(xì)胞的分化和轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色，提示在卵巢癌中Twist的作用機(jī)制是多樣而豐富的，從而4．1N對(duì)其的干預(yù)進(jìn)而產(chǎn)生效應(yīng)也是多因素共同作用的結(jié)果。除Twist外，Slug對(duì)于E-cad-herin的下調(diào)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)展也具有重要作用，這一過程離不開PI3K/Akt信號(hào)通路的激活;反之，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路能下調(diào)Slug進(jìn)而阻止癌細(xì)胞的侵襲。4．1N也能通過與PIKE(PI3KinaseEnhancer)的相互作用來調(diào)節(jié)PI3Kinase。本組前期進(jìn)行的蛋白質(zhì)譜檢測(cè)，其結(jié)果也支持4．1N與PI3K之間潛在的作用關(guān)系。蛋白質(zhì)譜結(jié)果提示過表達(dá)4．1N能上調(diào)多磷酸肌醇-5-磷酸酶的表達(dá)。磷酸肌醇-5-磷酸酶是一種PI3K相關(guān)的酶類，能促進(jìn)細(xì)胞死亡，提示PI3K信號(hào)通路調(diào)節(jié)也可能是4．1N在抑制腫瘤演進(jìn)中扮演一定的角色，但其具體的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。侵襲是腫瘤演進(jìn)過程的另一個(gè)重要環(huán)節(jié)。其中，MMPs能通過降解細(xì)胞外基質(zhì)而對(duì)腫瘤細(xì)胞的游走能力進(jìn)行正性調(diào)節(jié)，其中MMP-2在卵巢癌標(biāo)本中的表達(dá)水平明顯高于卵巢漿液腺瘤且與臨床分期密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)顯示，4．1N對(duì)ES-2細(xì)胞侵襲能力的抑制，4．1N可能通過抑制MMP的表達(dá)水平，從而起到抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的作用。綜上，4．1N蛋白參與負(fù)性調(diào)控卵巢透明細(xì)胞癌的演進(jìn)，具體調(diào)控機(jī)制可能涉及對(duì)緊密連接蛋白、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)調(diào)控，從而為卵巢透明細(xì)胞癌的診治和預(yù)后判斷提供了新的線索和靶標(biāo)。

作者：張樂天 任彩霞 安秀麗 劉從容 單位：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理系 解剖與組胚系 紅細(xì)胞生理實(shí)驗(yàn)室，紐約血液中心 鄭州科技大學(xué)生物工程系