上皮性卵巢癌基因甲基化研究范文

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《中華腫瘤防治雜志》2015年第二十期

【摘要】

目的RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白1A基因（RASassociateddomainfamily1Agene，RASSF1A）啟動(dòng)子區(qū)超甲基化介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄失活在卵巢癌中頻見，可作為卵巢癌診治過程中有意義的分子生物學(xué)指標(biāo)，RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白2A基因（RASassociateddomainfamily2Agene，RASSF2A）與RASSF1A同源，其基因異常甲基化在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究探討上皮性卵巢癌組織RASSF2A甲基化水平，并分析其臨床意義及高甲基化與mRNA表達(dá)情況的相關(guān)性。方法選擇2013－10－01－2014－12－31聊城市人民醫(yī)院手術(shù)治療的50例上皮性卵巢癌、27例交界性上皮性卵巢腫瘤和20例良性上皮性卵巢腫瘤患者，應(yīng)用甲基化特異性PCR（MSP）檢測卵巢腫瘤組織中RASSF2A基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，采用RT－PCR檢測其mRNA表達(dá)水平。采用5－氮雜2′－脫氧胞苷（5－aza－dC）對人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、3AO進(jìn)行去甲基化干預(yù)實(shí)驗(yàn)，并檢測藥物作用前后RASSF2A基因啟動(dòng)子甲基化及其mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果RASSF2A基因mRNA在良性上皮性卵巢腫瘤中的表達(dá)陽性率為95．00％（19／20），交界性上皮性卵巢腫瘤為59．26％（16／27），上皮性卵巢癌組織為34．00％（17／50），表達(dá)強(qiáng)度依次下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2＝21．855，P＜0．001。RASSF2A基因啟動(dòng)子在良性上皮性卵巢腫瘤組織中的甲基化率為0（0／20），交界性上皮性卵巢腫瘤為22．22％（6／27），上皮性卵巢癌組織為46．00％（23／50），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2＝15．474，P＜0．001。RASSF2A甲基化水平與卵巢癌患者的年齡、病理類型、臨床分期、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性。RASSF2A基因甲基化與其mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，甲基化陽性組織的mRNA表達(dá)水平明顯低于甲基化陰性組織。5－aza－dC藥物作用后，卵巢癌細(xì)胞株中RASSF2A基因甲基化被逆轉(zhuǎn)，而其基因表達(dá)明顯升高。結(jié)論RASSF2A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化導(dǎo)致的基因表達(dá)沉默與上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】

上皮性卵巢癌；甲基化；RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白2A基因；基因檢測

上皮性卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中惡性程度最高和預(yù)后最差的腫瘤，其病死率居?jì)D科惡性腫瘤首位［1］。大量研究已證實(shí)，RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白1A基因（RASassociateddomainfamily1Agene，RASSF1A）啟動(dòng)子區(qū)超甲基化介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄失活是卵巢癌中的頻發(fā)事件，可作為卵巢癌診治過程中有意義的分子生物學(xué)指標(biāo)［2－4］。與RASSF1A具有高度同源性的RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白1A基因（RASassociateddomainfamily2Agene，RASSF2A）異常甲基化在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究通過RT－PCR和MSP方法檢測良性上皮性卵巢腫瘤、交界性上皮性卵巢腫瘤和上皮性卵巢癌組織及卵巢癌細(xì)胞株中RASSF2AmRNA的表達(dá)及其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，分析RASSF2A啟動(dòng)子甲基化與其mRNA的表達(dá)以及卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系，探討RASSF2A啟動(dòng)子區(qū)甲基化在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1材料與方法

1．1標(biāo)本來源收集2013－10－01－2014－12－31聊城市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的上皮性卵巢癌患者50例，交界性上皮性卵巢腫瘤27例，良性上皮性卵巢腫瘤20例。所有組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)確診，所有患者術(shù)前均未接受任何放化療或激素治療。標(biāo)本采集在離體后10min內(nèi)進(jìn)行，并迅速放入液氮罐保存，后轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱保存。上皮性卵巢癌病例中，依據(jù)2006年FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期31例；依據(jù)2003年WHO組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，漿液性腺癌24例，黏液性腺癌16例，子宮內(nèi)膜樣癌10例；高分化10例，中分化15例，低分化25例；有淋巴轉(zhuǎn)移27例，無淋巴轉(zhuǎn)移23例；年齡＜50歲者19例，≥50歲者31例。

1．2細(xì)胞株卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和3AO由聊城市人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1．3主要試劑Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，DNA甲基化試劑盒購自德國Qiagen公司，引物均由上海生工設(shè)計(jì)合成。

1．4實(shí)驗(yàn)方法

1．4．1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理在37℃、5％CO2及飽和濕度的孵育箱中靜置培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞株，用含10％胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基及時(shí)換液。用終濃度為10μmol／L的5－aza－dC處理卵巢癌細(xì)胞株，常規(guī)換液，保持上述藥物濃度。于藥物連續(xù)作用72h后收集細(xì)胞。

1．4．2RT－PCR檢測參照Trizol試劑說明書提取組織及細(xì)胞總RNA。測得其濃度及純度符合實(shí)驗(yàn)要求后，取2μL總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。所得cDNA經(jīng)半定量PCR擴(kuò)增。RASSF2A基因上游序列為5′－GCG－CCTAGAACGTGTTTTTC－3′，下游序列為5′－ACT－AGGCGTCCTCACATTGC－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為563bp。以GAPDH作為內(nèi)參基因，上游為5′－CAA－CGGATTTGGTCGTATT－3′，下游為5′－CACAGTC－TTCTGGGTGGC－3′，擴(kuò)增片段長度為166bp。PCR反應(yīng)條件為95℃10min，95℃30s，58℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1．4．3DNA的提取及亞硫酸鹽修飾采用酚氯仿法提取組織及細(xì)胞總DNA，并對基因組DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾，按照甲基化特異性PCR試劑盒說明書進(jìn)行。所得產(chǎn)物直接用于PCR擴(kuò)增或保持在－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4．4甲基化特異性PCR使用2對引物檢測RASSF2A基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。甲基化引物正義鏈為5′－GTTCGTCGTCGTTTTTTAGGCG－3′，反義鏈為5′－AAAAACCAACGACCCCCGCG－3′，非甲基化引物正義鏈為5′－AGTTTGTTGTTGTTTTTTA－GGTGG－3′，反義鏈為5′－AAAAAACCAACAACCC－CCACA－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度均為108bp。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10min，95℃變性30s，58℃復(fù)性30s（甲基化）；54℃復(fù)性30s（非甲基化），72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。所得產(chǎn)物電泳后攝像，分析結(jié)果。

1．4．5甲基化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)若僅甲基化引物擴(kuò)增出陽性條帶，為完全甲基化；若僅非甲基化引物擴(kuò)增出陽性條帶，為非甲基化；若兩者均擴(kuò)增出陽性條帶，為部分甲基化。

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13．0分析數(shù)據(jù)。RASSF2A甲基化、mRNA表達(dá)在卵巢腫瘤組織間的差異以及基因甲基化與臨床病理特征等計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fishier確切概率法。RASSF2A甲基化及其表達(dá)之間的關(guān)系采用Spearman相關(guān)性分析法。卵巢癌細(xì)胞系中RASSF2AmRNA表達(dá)量比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0．05。

2結(jié)果

2．1卵巢腫瘤組織RASSF2AmRNA的表達(dá)表1和圖1所示，卵巢良性腫瘤、交界性腫瘤及卵巢癌組織中RASSF2AmRNA表達(dá)率依次降低，分別為95．00％（19／20）、59．26％（16／27）和34．00％（17／50），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2＝21．855，P＜0．001。兩兩比較結(jié)果顯示，卵巢癌組與交界性腫瘤組比較，χ2＝4．568，P＝0．033；卵巢癌組與良性腫瘤組比較，χ2＝21．280，P＜0．001；交界性腫瘤組與良性腫瘤組比較，χ2＝7．719，P＝0．005；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2．2卵巢腫瘤組織RASSF2A基因甲基化水平表1和圖2所示，97例卵巢組織標(biāo)本均成功進(jìn)行了MSP實(shí)驗(yàn)。50例卵巢癌組織標(biāo)本中有13例發(fā)生了部分甲基化，10例完全甲基化，甲基化頻率為46．00％（23／50）；27例交界性卵巢腫瘤中甲基化陽性率為22．22％（6／27），其中2例為完全甲基化。而20例良性卵巢腫瘤組織均未擴(kuò)增出甲基化陽性條帶，甲基化頻率為0，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2＝15．474，P＜0．001。

2．3RASSF2A基因甲基化與其表達(dá)的相關(guān)性表2所示，RASSF2A基因甲基化狀態(tài)與其mR－NA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。在RASSF2A基因發(fā)生甲基化的組織中，RASSF2A基因表達(dá)明顯降低，提示RASSF2A基因高甲基化可能是該基因表達(dá)沉默的原因之一。

2．4甲基化狀態(tài)與卵巢癌臨床病理特征相關(guān)性表3所示，RASSF2A甲基化程度與卵巢癌患者的年齡、病理類型、臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間無明顯的相關(guān)性。

2．55－aza－dC作用結(jié)果圖3所示，卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和3AO中均檢測到RASSF2A基因甲基化，經(jīng)去甲基化藥物5－aza－dC作用后，SKOV3細(xì)胞由完全甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)榉羌谆?AO細(xì)胞甲基化狀態(tài)被部分逆轉(zhuǎn)。SKOV3和3AO中RASSF2AmRNA表達(dá)水平較低，經(jīng)藥物干預(yù)后，SKOV3（t＝－5．258，P＝0．006）和3AO細(xì)胞株（t＝－3．060，P＝0．038）RASSF2AmRNA表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

近年來，隨著腫瘤分子生物學(xué)及表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，腫瘤抑制基因失活在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到人們的重視。總的來說，其機(jī)制可概括為遺傳學(xué)機(jī)制及表觀遺傳學(xué)機(jī)制，換言之，腫瘤抑制基因功能的失活既可以是不可逆的，即遺傳學(xué)機(jī)制，如基因的突變或染色體的缺失，也可以是可逆的，即表觀遺傳學(xué)機(jī)制，如基因甲基化或組蛋白修飾。與遺傳學(xué)不同，表觀遺傳學(xué)主要研究內(nèi)容不涉及DNA序列的改變，且在細(xì)胞分裂過程中具有可遺傳的、可逆性的基因組修飾作用［5］。DNA甲基化是哺乳動(dòng)物基因組中最普遍的表觀遺傳學(xué)事件。相對于Knudson’s的二次打擊學(xué)說，基因甲基化僅靠一次打擊就可導(dǎo)致基因失活，腫瘤易感性增加［6］。RASSF2是新近發(fā)現(xiàn)的RASSF家族成員之一，生物信息學(xué)分析顯示，RASSF2與其他成員一樣，也含有RAS相關(guān)域［7］。RASSF2位于人類常染色體20p13，有329個(gè)氨基酸的開放閱讀框，11個(gè)外顯子。根據(jù)不同的啟動(dòng)子和外顯子選擇剪接，可形成RASSF2A、RASSF2B和RASSF2C3個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本，其中，RASSF2A是最長的轉(zhuǎn)錄本，也是唯一一個(gè)含有5′CpG島的轉(zhuǎn)錄本。RASSF2A在卵巢癌組織中發(fā)揮抑癌基因的作用，如抑制細(xì)胞生長，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡等，是一個(gè)腫瘤抑制基因。本研究分析了RASSF2A基因在上皮性卵巢癌組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)及其甲基化水平。RT－PC檢測結(jié)果顯示，RASSF2A基因表達(dá)水平在良性卵巢腫瘤、交界性腫瘤及卵巢癌組織中依次降低，提示RASSF2A的轉(zhuǎn)錄失活，可能參與了卵巢癌的惡性演進(jìn)過程，RASSF2A在上皮性卵巢癌中也起到抑癌基因的作用。張嫻等［8］研究結(jié)果顯示，RASSF2A基因甲基化可能參與了宮頸癌的發(fā)生，與宮頸癌的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，良性卵巢腫瘤組織中未發(fā)生RASSF2A啟動(dòng)子區(qū)甲基化，而基因異常甲基化從交界性腫瘤到癌呈逐漸上升的趨勢，RASSF2A基因甲基化從無到有，從少到多的現(xiàn)象，說明了RASSF2A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化從卵巢上皮增殖階段就開始起作用，與卵巢癌發(fā)生密切相關(guān)。多項(xiàng)研究表明，RASSF2A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化與基因表達(dá)沉默有關(guān)［9－11］。本研究結(jié)果表明，在發(fā)生RASSF2A甲基化的組織中，其基因表達(dá)水平明顯下降，兩者呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果提示，在卵巢癌中RASSF2A啟動(dòng)子甲基化是導(dǎo)致其低表達(dá)或者表達(dá)缺失的重要原因，這在細(xì)胞試驗(yàn)中也得到驗(yàn)證。應(yīng)用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5－aza－dC對卵巢癌細(xì)胞株進(jìn)行去甲基化處理后，卵巢癌細(xì)胞株的基因啟動(dòng)子甲基化被逆轉(zhuǎn)，而其mR－NA的表達(dá)水平明顯升高，從而進(jìn)一步證實(shí)了RASSF2A啟動(dòng)子CpG島的異常甲基化在調(diào)節(jié)RASSF2A基因的表達(dá)中發(fā)揮重要作用。研究顯示，RASSF2A基因甲基化程度與宮頸癌、胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)［8，12］，而與胰腺癌和結(jié)直腸癌［9，13］患者臨床病理特征無關(guān)。另有研究表明，基因啟動(dòng)子甲基化水平與癌癥患者年齡密切相關(guān)［14］。在子宮內(nèi)膜癌的研究中顯示，＞45歲的患者更容易發(fā)生RASSF2A甲基化（P＝0．041）［15］。在結(jié)腸癌和口腔鱗癌中也發(fā)現(xiàn)，RASSF2A基因甲基化程度與年齡相關(guān)［13，16］。在生物個(gè)體發(fā)育過程中，伴隨著時(shí)間的進(jìn)程，DNA甲基化異常會(huì)不斷呈現(xiàn)，由此認(rèn)為，表觀遺傳學(xué)疾病是一種與年齡相關(guān)性疾病。這在某種程度上解釋了為什么腫瘤多發(fā)生在老年人。檢測DNA甲基化程度可作為細(xì)胞衰老的標(biāo)志之一。本研究結(jié)果顯示，RASSF2A基因甲基化水平與卵巢癌患者的臨床病理參數(shù)之間無明顯的相關(guān)性，是上皮性卵巢癌中的早期頻發(fā)事件，隨著患者年齡的增加，RASSF2A基因甲基化有增高的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能上皮性卵巢癌中RASSF2A基因甲基化不是年齡相關(guān)的表觀遺傳學(xué)改變。

綜上所述，RASSF2A啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化是卵巢癌發(fā)生和發(fā)展過程中的頻發(fā)事件，是導(dǎo)致卵巢癌中RASSF2A低表達(dá)或表達(dá)缺失的重要原因，其參與了卵巢癌的發(fā)病過程，并在卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。監(jiān)測RASSF2A基因啟動(dòng)子CpG島甲基化水平可作為表觀遺傳學(xué)的分子靶標(biāo)，指導(dǎo)卵巢癌的診斷及其預(yù)后判定。

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作者：武玉 路煒 劉穎 欒鑫 吳秀芳 單位：聊城市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科 聊城市東昌府人民醫(yī)院婦產(chǎn)科