番茄紅素在大鼠肝臟中的幾何異構(gòu)體范文

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《食品科學(xué)雜志》2015年第二十四期

摘要：

本項(xiàng)研究的目的是測定大鼠肝臟組織中番茄紅素的含量及番茄紅素幾何異構(gòu)體（順/反異構(gòu)體）的組成，為番茄紅素在體內(nèi)的代謝及生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。在實(shí)驗(yàn)中，選用大鼠為動物模型，用番茄提取物配制灌胃液。一次灌胃8小時后取大鼠肝臟組織，提取其中的番茄紅素。應(yīng)用C30-HPLC-PDA法測定提取物中番茄紅素的總量和幾何異構(gòu)體組成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：肝臟中總番茄紅素含量為92.95微克/克鮮重。與灌胃液中的番茄紅素幾何異構(gòu)體組成比較，肝臟組織中存在更多數(shù)量和種類的順式異構(gòu)體，包括：13順-、11順-、9順-和5順-異構(gòu)體。這一現(xiàn)象對研究番茄紅素在肝臟內(nèi)的貯存、靶向調(diào)動和生物學(xué)功能研究具有重要意義。

關(guān)鍵詞：

番茄紅素；幾何異構(gòu)體；肝臟；C30-HPLC；代謝

番茄紅素（Lycopene）是一種類胡蘿卜素（Carotenoid），由碳?xì)湓亟M成。其半系統(tǒng)命名為　　　　胡蘿卜素，分子式為C40H56。番茄紅素分子由中央多聚烯鏈和開環(huán)末端基團(tuán)構(gòu)成。由于其具有高度的不飽和性，番茄紅素因此在理論上可形成多種幾何異構(gòu)體。在自然界中番茄紅素通常以全反式異構(gòu)體（AllE-isomer）的形式存在。其分子結(jié)構(gòu)見圖1。在自然界中，番茄紅素同時還存在著少量順式異構(gòu)體（Z-isomer）。最常見的有13-、9-和5-三種單順式異構(gòu)體[1]。由于其分子空間結(jié)構(gòu)不同，番茄紅素各異構(gòu)體的生物學(xué)功能也有所不同。根據(jù)文獻(xiàn)報道，在體外抗氧化實(shí)驗(yàn)中，全反式異構(gòu)體的抗氧化性明顯優(yōu)于順式異構(gòu)體。但由于順式異構(gòu)體在體內(nèi)溶解性好，生物利用度高，故其在體內(nèi)的抗氧化性反而高于全反式異構(gòu)體[2]。

番茄紅素具有預(yù)防與治療多種疾病的功能。這方面的研究成果及報道迅速增多，如：防治前列腺增生及癌癥[3]、體內(nèi)抗氧化[4]、抗消化道癌變[5]、降低肺癌風(fēng)險[6]、抗糖尿病[7]、控制體重[8]等。因此番茄紅素也被越來越多地考慮應(yīng)用在功能性食品中[9]。這些應(yīng)用推動了對番茄紅素在體內(nèi)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的研究，但目前其相關(guān)報道十分有限。已有的報道可概括為：被人體攝入的番茄紅素經(jīng)小腸吸收進(jìn)入血清，然后被轉(zhuǎn)運(yùn)到靶器官。其中一部分轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟中貯存。當(dāng)靶器官需要時，再從肝臟調(diào)出，再經(jīng)血清轉(zhuǎn)運(yùn)至靶器官參與代謝反應(yīng)（如圖2所示）[10]。肝臟在這一過程中被認(rèn)為執(zhí)行了“庫”的功能。因此，研究肝臟中番茄紅素的存在形式對探討其在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和在靶器官中發(fā)生的代謝反應(yīng)機(jī)制具有重要意義。惠伯棣等人已經(jīng)報道了一次口服番茄紅素后雄性大鼠肝臟中番茄紅素的積累情況[11]和應(yīng)用C30-HPLC-PDA分離和檢測番茄紅素幾何異構(gòu)體的方法[12,13,14,15]。在本項(xiàng)研究中，采用了這一方法對肝臟中的番茄紅素幾何異構(gòu)體組成進(jìn)行了檢測。希望這一檢測的結(jié)果對揭示番茄紅素在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝機(jī)理有一定幫助。

1.材料與方法

1.1番茄萃取物果實(shí)在本項(xiàng)研究中使用的番茄萃取物由新疆紅帆生物科技有限公司提供，該產(chǎn)品為番茄果皮的超臨界CO2流體萃取物。其總類胡蘿卜素含量為6%（W/W）。其中，番茄紅素占94.74%（W/W），　-胡蘿卜素占5.26%（W/W）。

1.2試劑番茄紅素參比樣品（P/N：L9879）購自Sigma公司，番茄紅素含量在90-95%范圍內(nèi)。使用前用本項(xiàng)研究中采用的色譜條件檢測了其番茄紅素幾何異構(gòu)體組成。其全反式異構(gòu)體的比例大于99%。故使用前未經(jīng)進(jìn)一步純化。萃取用正己烷、甲醇、石油醚（BP：60-90℃）為分析純試劑，購自北京化工廠。色譜用流動相乙腈、甲醇和甲基叔丁基醚（MTBE）為色譜純試劑，購自迪馬公司（DickmaTechnologies,USA）。

1.3實(shí)驗(yàn)動物SD雄性大鼠購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心，體重350克（±5克）。實(shí)驗(yàn)動物合格證號：SCXK京2006-0008。

1.4儀器Multispec-1501型紫外-可見光分光光度計（SHIMADZU，Japan）；HPLC：Waters1525系統(tǒng)配有PDA-2996檢測器（Waters，USA）。

1.5灌喂劑量的選擇本項(xiàng)研究中選用的番茄紅素灌胃劑量參照李京等在番茄紅素血清動力學(xué)研究中的劑量[16]，為5.25mg/次•只，折合標(biāo)準(zhǔn)體重（50公斤）人體攝入量為150mg/次•人。

1.6灌胃液的配制稱取一定量的番茄萃取物完全溶于正己烷中，再混溶于100mL豆油中。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在45℃、-0.06MPa、避光條件下將正己烷完全蒸出。用石油醚定量稀釋油溶液。在紫外-可見光分光光度計上，在475nm下，比色稀釋液。根據(jù)下式計算油溶液中番茄紅素的濃度[17]。最終，使配制成的番茄紅素油溶液濃度為5.25mg/ml。避光保存。操作注意事項(xiàng)：（1）在蒸發(fā)正己烷期間應(yīng)注意嚴(yán)格避光，以避免在加熱的狀態(tài)下油溶液中大量全反式番茄紅素發(fā)生幾何異構(gòu)化。（2）灌胃液的配制應(yīng)遵循隨用隨配的原則。不建議將其放在冰箱中貯存。原因是在4℃條件下番茄紅素在油溶液中已形成顆粒結(jié)晶，導(dǎo)致灌胃液不均勻和生物利用度的下降。

1.7實(shí)驗(yàn)動物灌胃與肝臟收集雄性SD大鼠在動物房中用標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)3天。隨機(jī)分成2組。第一組6只，第二組3只。第一組每只灌胃1mL灌胃液。根據(jù)李京等人的報道[20]：攝入番茄紅素12小時后，血清中番茄紅素水平下降到最低檢測限。根據(jù)惠伯棣等人的報道[11]，攝入番茄紅素8小時后，雄性大鼠肝臟中番茄紅素積累水平達(dá)到最高值。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，灌胃8小時后采用股動脈放血法處死大鼠，取肝臟。平均肝重為11.72±0.74克。第二組每只灌胃1mL豆油。灌胃8小時后采用股動脈放血法處死大鼠，取肝臟。平均肝重為11.81±0.24克。

1.8番茄紅素的萃取與濃縮本研究中所采用的肝臟中總類胡蘿卜素萃取方法參照F.Khachik于1992年報道的方法[21]，并作了相應(yīng)的優(yōu)化，以使番茄紅素的萃取率提高，降解率最低。在實(shí)驗(yàn)中，將大鼠肝臟用組織勻漿器進(jìn)行破碎后，取4克肝臟勻漿液加入2mL（-20℃）甲醇，振蕩30秒，沉淀蛋白。向帶有蛋白沉淀的懸濁液中加入3mL正己烷，振蕩10min。在4600rpm下離心10min，取上清液2.6mL，用N2吹干至1mL。全程避光，并于冰浴中操作。按上述方法萃取每只大鼠肝臟中的類胡蘿卜素，肝臟提取物樣品用于HPLC分析前10000rpm離心3min。取上清液進(jìn)樣。

1.9肝臟萃取物的C30-HPLC-PDA分析用于本項(xiàng)研究的C30-HPLC-PDA設(shè)備具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性（RSD<7%）。HPLC條件已由丁靖等人報道[17]，并優(yōu)化如下：HPLC條件：色譜柱：YMCCarotenoidS-5（4.6×250mm）；流動相A：乙腈-甲醇（3:1,V/V）；流動相B：MTBE；流動相A與B中分別加入0.05%（V/V）三乙胺；線性梯度洗脫：B在8min內(nèi)由0增加至55%（V/V）；8-40min內(nèi)B維持在55%；流速：1.0mL/min；檢測波長：475nm；PDA光譜收集范圍260-600nm；進(jìn)樣量：20　L。對各組分積分得峰面積。

1.10灌胃液的C30-HPLC-PDA分析取0.5mL灌胃液，用正己烷定容至50mL。取1mL定容液，在10000rpm下離心3min。取上清液進(jìn)樣。色譜條件見1.9節(jié)。

1.11標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定準(zhǔn)確（至0.0001克）稱取番茄紅素參比樣品1mg，加入1mL二氯甲烷使其完全溶解，轉(zhuǎn)移至25mL棕色容量瓶中，用石油醚（BP:60～90°C）定容至25mL，配制成40　g/mL的儲備液，保存于-20℃冰箱中。使用前用石油醚配制6個不同質(zhì)量濃度的工作液。分別進(jìn)樣，在C30-HPLC上測定全反式番茄紅素組分含量與其色譜峰面積的相關(guān)關(guān)系，得到濃度-峰面積線性回歸曲線和方程，R2為0.996。

1.12各番茄紅素幾何異構(gòu)體組分的定性與定量根據(jù)組分的色譜行為和光譜特征對番茄紅素幾何異構(gòu)體進(jìn)行鑒定。對各組分在色譜圖上峰面積和濃度-峰面積線性回歸方程，計算各組分的質(zhì)量濃度。根據(jù)李京等人的報道[22]，雖然番茄紅素順式異構(gòu)體的吸光系數(shù)與全反式異構(gòu)體的不同，但這一結(jié)果尚未經(jīng)其他實(shí)驗(yàn)室證實(shí)。因此，在本項(xiàng)研究中時，依舊根據(jù)全反式異構(gòu)體的吸光系數(shù)計算順式異構(gòu)體的含量。

2.結(jié)果與分析

2.1灌胃液中類胡蘿卜素組分的分離由新疆紅帆生物科技有限公司提供的番茄紅素萃取物為番茄果皮的超臨界CO2萃取物，該萃取物中所含主要類胡蘿卜素為番茄紅素，此外，還含有少量的　-胡蘿卜素。其中除全反式番茄紅素外，還含有少量的順式番茄紅素。圖3為這一萃取物的C30-HPLC-PDA色譜圖。組分I的保留時間與番茄紅素全反式異構(gòu)體參比樣品的保留時間一致。

2.2肝臟萃取物中類胡蘿卜素組分的分離根據(jù)惠伯棣等人的報道[11]，灌胃8小時后，雄性大鼠肝臟中番茄紅素的積累量達(dá)到最高水平。因此，在本項(xiàng)研究中，在灌胃8小時后，摘除大鼠肝臟，取4克肝組織，萃取其中的類胡蘿卜素，用C30-HPLC-PDA，分離其中的類胡蘿卜素組分。圖4為灌胃8小時后肝臟萃取物的C30-HPLC色譜圖。組分I的保留時間與番茄紅素全反式異構(gòu)體參比樣品的保留時間一致。

2.3各組分電子吸收光譜特征比較使用HPLC上配備的PDA檢測器，可在線采集各組分的電子吸收光譜。圖5為組分I、II、III、IV和V的電子吸收光譜比較。表1為各組分電子吸收光譜特征比較。從表中可以看出，五個組分的主吸收帶最大吸收波長發(fā)生了7nm的變化。順式峰最大吸收波長（362nm）未見明顯變化。

2.4灌胃液與肝臟提取物中番茄紅素幾何異構(gòu)體的定性根據(jù)各組分的色譜行為和光譜特征對各組分定性。定性結(jié)果認(rèn)為I、II、III、IV、V和VI分別為全反式-番茄紅素、5順-番茄紅素、9順-番茄紅素、11順-番茄紅素、13順-番茄紅素和　-胡蘿卜素，其中除了組分IV未得到質(zhì)譜數(shù)據(jù)支持，其它均有參考文獻(xiàn)支持。圖6為各順式異構(gòu)體的分子結(jié)構(gòu)。

2.5灌胃液與肝萃取物中番茄紅素幾何異構(gòu)體的定量表2為各異構(gòu)體組分的含量。從表2可以看出：在灌胃液中，番茄紅素以全反式異構(gòu)體為主存在形式，此外還含有少量的11-順式異構(gòu)體，其它種類異構(gòu)體比例極低。與灌胃液中的情況相比，肝臟中含有大量的番茄紅素順式異構(gòu)體，包括：13-順式異構(gòu)體、11-順式異構(gòu)體、9-順式異構(gòu)體和5-順式異構(gòu)體。換言之，從肝臟檢出的番茄紅素組分中，順式異構(gòu)體比例明顯上升，總順式異構(gòu)體比例超過60%。同時，全反式番茄紅素比例下降。

3.討論

全反式番茄紅素在肝臟中以大量順式異構(gòu)體形態(tài)存在的現(xiàn)象在國內(nèi)外文獻(xiàn)中未見報道。這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)可能對番茄紅素生物學(xué)功能和在體內(nèi)代謝的研究產(chǎn)生重要的影響。根據(jù)李京等人的報道[20]，番茄紅素在血中的存在形式就包括大量的順式異構(gòu)體。因此，來自消化道的全反式異構(gòu)體發(fā)生順式異構(gòu)化的位置應(yīng)該不在肝臟中。此外，由于不同異構(gòu)體在體內(nèi)的溶解性和抗氧化能力均有所不同[23]，可以設(shè)想在肝臟內(nèi)中存在的順式異構(gòu)體具有不同于全反式異構(gòu)體的生物學(xué)功能。當(dāng)體內(nèi)靶器官需要調(diào)動貯存在肝臟內(nèi)的番茄紅素時，肝臟中的各種幾何異構(gòu)體以何種形態(tài)和數(shù)量再度進(jìn)入血液是非常有價值進(jìn)行探討的問題。上述問題的探討將有助于推動番茄紅素在體內(nèi)的代謝和生物功能研究的進(jìn)一步發(fā)展。

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作者：惠伯棣 馮潤月 宮平 單位：北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院食品科學(xué)系