長鏈非編碼在肝細(xì)胞肝癌中的意義范文

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摘要：目的探討lncRNACCAT1在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及其臨床意義。方法采用熒光定量PCR檢測檢測96例肝癌癌灶組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNACCAT1的表達(dá)情況，并分析與各臨床病理因素以及患者預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果lncRNACCAT1在肝癌癌灶組織表達(dá)升高;肝癌癌灶組織中l(wèi)ncRNACCAT1表達(dá)量和門靜脈癌栓、TNM分期等因素相關(guān)。進(jìn)一步生存分析發(fā)現(xiàn)lncRNACCAT1表達(dá)陽性者術(shù)后平均生存時間(32．1個月，95%CI:26．3～38．0個月)明顯短于陰性患者(47．2個月，95%CI:42．5～52．0個月)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7．607，P=0．006)。并且lncRNACCAT1表達(dá)是肝癌患者總體生存的獨立危險因素。結(jié)論lncRNACCAT1表達(dá)在肝癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用;lncRNACCAT1表達(dá)是肝癌患者的獨立預(yù)后因素。

關(guān)鍵詞：長鏈非編碼RNACCAT1肝細(xì)胞肝癌生存分析

肝癌是世界范圍內(nèi)的高發(fā)惡性腫瘤之一，盡管隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，肝癌的診療手段已漸趨成熟，但是其術(shù)后5年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)80%，每年約有超過600000人死于肝癌，缺乏有效的診療、監(jiān)測靶點是造成肝癌患者預(yù)后低下的原因［1］。長鏈非編碼RNA(longnon－codingRNA，lncRNA)是一組長度＞200個核苷酸、缺少完整的開放閱讀框和無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA。近年來研究顯示，lncRNA具有各種不同的生物學(xué)功能，作為抑癌或致癌基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。lncRNACCAT1被證實高表達(dá)于結(jié)腸癌、胃癌、膽囊癌，然而在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)情況仍不清楚［2～4］。本研究中筆者采用熒光定量PCR法檢測肝癌組織中l(wèi)ncRNACCAT1中的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理因素的相關(guān)性。

材料與方法

1．標(biāo)本來源:

收集2005年9月～2010年10月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬浙江省臺州醫(yī)院接受手術(shù)治療的96例HCC患者的組織標(biāo)本(包括癌灶組織及相應(yīng)癌旁組織)，術(shù)后均確診為肝細(xì)胞肝癌。腫瘤病理診斷參照世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)、臨床分期標(biāo)準(zhǔn)參照美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)制定的第7版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)［5］。術(shù)前患者均未接受放化療或其他任何藥物干預(yù)。并有完整臨床病理資料(年齡、性別、病理診斷、門靜脈癌栓、酗酒、腫瘤直徑、TMN分期等)。所有患者中位隨訪時間為38．5個月(2．0～60．0個月)，其中57例死于肝癌。為研究lncRNACCAT1的臨床相關(guān)性，筆者根據(jù)CCAT1表達(dá)量將數(shù)據(jù)平均分為兩組，即CCAT1高表達(dá)組和CCAT1低表達(dá)組，并對肝癌組織中l(wèi)ncRNACCAT1的表達(dá)量與各臨床病理因素的關(guān)系進(jìn)行分析。所有人體標(biāo)本的研究均事先獲得倫理委員會的批準(zhǔn)。

2．實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real－timePCR)檢測肝癌及癌旁組織中l(wèi)ncRNACCAT1的表達(dá):

采用Tr-izol試劑盒(美國Invitrogen公司，Carlsbad，CA)試劑盒抽提總RNA。采用ABI公司的HighCapacitycD-NAReverseTranscription試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):25℃10min，37℃120min，85℃5min，4℃保存。RT－PCR采用ABI公司PowerSYBRGreenPCRMastermix試劑盒及ABI7900HT系統(tǒng)，以GAPDH為內(nèi)參基因，使用2－△△Ct法計算lncRNACCAT1在肝癌組織相對于癌旁組織的表達(dá)量，并根據(jù)其表達(dá)水平中位數(shù)將肝癌患者分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，分析CCAT1表達(dá)與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。引物序列如下:CCAT1上游引物:5'－GCCGTGTTAAGCATTGCGAA－3'，下游引物:5'－AGAGTAGTGCCTGGCCTAGA－3';GAPDH上游引物:5'－GAAATCCCATCACCACTTCCAGG－3'，下游引物:5'－GAGCCCCAGCCTTCTCCATG－3'。

3．統(tǒng)計學(xué)方法:

實驗結(jié)果應(yīng)用SPSS20．0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。不同組間的差異評估采用Student'st－test或χ2檢驗，生存分析用Kaplan－Meier和Log－rank檢驗，多因素分析用COX回歸模型，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1．lncRNACCAT1在肝癌癌灶及癌旁組織中的表達(dá):qRT－PCR結(jié)果經(jīng)Student'st－test檢驗提示肝癌組織中l(wèi)ncRNACCAT1較癌旁組織明顯低表達(dá)(P=0．000)，見圖1。圖2．肝癌中l(wèi)ncRNACCAT1的表達(dá)量與臨床病理因素的關(guān)系:lncRNACCAT1的表達(dá)量與門靜脈癌栓(χ2=15．229，P＜0．05)及TNM分期(χ2=4．196，P=0．041)具有相關(guān)性，而與患者年齡、性別、腫瘤直徑、酗酒等無明顯相關(guān)(P＞0．05，表1)。

3．lncRNACCAT1與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系:

對96例肝癌患者進(jìn)行生存分析。Kaplan－Meier分析顯示:HLA－F陽性患者術(shù)后平均生存時間為32．1個月(95%CI:26．3～38．0個月);HLA－F陰性患者術(shù)后平均生存時間為47．2個月(95%CI:42．5～52．0個月)。HLA－F陽性患者生存時間短于陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7．607，P=0．006，圖2)。COX回歸模型分析肝癌患者預(yù)后影響因素，單因素分析顯示:HLA－F表達(dá)、TNM分期均是肝癌患者術(shù)后生存時間的危險因素。多因素分析顯示HLA－F更是影響肝癌患者術(shù)后生存的獨立危險因素(表2)。

討論

長鏈非編碼RNA(longnoncodingRNA，lncRNA)是一群長度＞200bp的RNA，不具有編碼功能，以往認(rèn)為其是RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄副產(chǎn)物，不具備生物學(xué)功能［6］。但是近些年來研究表明，lncRNA可以在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后等不同水平參與下游基因的調(diào)控，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［6～8］。其可能的作用機(jī)制:①按照堿基配對原則，參與mRNA前體修飾;②與蛋白質(zhì)或miRNA結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá);③招募染色質(zhì)修飾酶復(fù)合物致目標(biāo)基因區(qū)域，參與其表觀遺傳學(xué)修飾［9～11］。lncRNACCAT1是一個擁有2628bp的非編碼RNA分子，最早在結(jié)腸癌中被發(fā)現(xiàn)，位于8q24．21、轉(zhuǎn)錄因子C－Myc附近，研究表明這是基因突變的高發(fā)區(qū)［12］。近年來已有研究顯示CCAT1在膽管癌等腫瘤組織中高表達(dá)［13～15］，參與腫瘤惡性進(jìn)展。Jiang等［13］研究發(fā)現(xiàn)CCAT1在膽管癌組織中的表達(dá)較癌旁組織高，其表達(dá)量與組織分化程度、淋巴結(jié)侵襲、TNM分期及患者預(yù)后相關(guān)，是膽管癌患者的獨立預(yù)后因素。Zhang等［14］研究顯示CCAT1可通過負(fù)調(diào)控miR－218－5P促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤SO－RB50及Y79細(xì)胞株的增殖、侵襲、遷徙、并減少凋亡，可作為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的潛在治療靶點。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌患者中l(wèi)ncRNACCAT1和HOTAIR表達(dá)升高，有望成為結(jié)腸癌篩查指標(biāo)，提高結(jié)腸癌陽性診斷率。筆者采用RT－PCR法分析了lncRNACCAT1肝癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn):①lncRNACCAT1在肝癌癌灶組織中表達(dá)升高;②其表達(dá)量與患者年齡、腫瘤直徑、漿膜侵犯、TNM分期等無明顯相關(guān)，而與門靜脈癌栓和腫瘤數(shù)目表現(xiàn)出一定相關(guān)性;結(jié)合上述兩點，筆者推測lncRNACCAT1高表達(dá)可能在肝癌惡性進(jìn)展中發(fā)揮重要作用;③生存分析發(fā)現(xiàn)lncRNACCAT1表達(dá)陽性患者預(yù)后較差，可作為肝癌患者預(yù)后的獨立危險因素。總之，筆者研究了lncRNACCAT1在肝癌組織中的表達(dá)特點和預(yù)后意義，推測lncRNACCAT1表達(dá)在肝癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用;并且lncRNACCAT1表達(dá)與預(yù)后相關(guān)，是肝癌患者的獨立預(yù)后影響因素，對判斷肝癌患者預(yù)后具有重要參考價值。但lncRNACCAT1在人體生理病理中其臨床意義及作用機(jī)制等研究剛剛起步，仍需要進(jìn)一步探索。

作者：陳思思陳霞蔣瓊英徐永富朱昱胡鵬單位：溫州醫(yī)科大學(xué)附屬浙江省臺州醫(yī)院口眼中心