高尿酸血癥對(duì)缺血性腦卒中的作用范文

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摘要：目的：探討高尿酸血癥對(duì)缺血性腦卒中的影響。方法：175只Wistar大鼠，分為空白對(duì)照組（35只，不做任何處理）和大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）組（140只），MCAO組又根據(jù)是否給予及給予抗高尿酸藥物別嘌呤醇（All）濃度不同分為：MCAO對(duì)照組（35只）、MCAO＋All（10mg）組（35只）、MCAO＋All（20mg）組（35只）和MCAO＋All（30mg）組（35只）；測(cè)定比較各組大鼠血清及腦組織中尿酸、IL－6和TNF－α水平及蛋白表達(dá)，以及腦梗死面積。結(jié)果：MCAO組血清尿酸水平顯著高于空白對(duì)照組［（90．38±31．27）mmol／L比（56．26±8．82）mmol／L］，P＝0．001。與MCAO對(duì)照組比較，MCAO＋All10mg，20mg和30mg組中血清及腦組織中IL－6［血清：（25．63±0．7）ng／L比（23．52±0．6）ng／L、（18．33±0．9）ng／L、（20．11±0．8）ng／L，腦組織：（1．20±0．32）ng／L比（0．98±0．26）ng／L、（0．64±0．34）ng／L、（0．87±0．16）ng／L］和TNF－α［血清：（200．42±8．2）ng／L比（184．37±6．2）ng／L、（165．75±6．8）ng／L、（171．25±7．5）ng／L，腦組織：（2．41±0．6）ng／L比（2．12±0．2）ng／L、（1．62±0．8）ng／L、（1．77±0．5）ng／L］水平和蛋白表達(dá)均明顯降低，腦梗死面積［（48．42±6．2）％比（40．25±3．1）％、（10．48±4．2）％、（22．42±5．2）％］均明顯縮小；且MCAO＋All（20mg）組的血清及腦組織中IL－6和TNF－α水平及蛋白表達(dá)最低，腦梗死面積最小（P＜0．05或＜0．01）。結(jié)論：缺血性腦卒中大鼠尿酸水平明顯升高，抑制尿酸水平可改善炎癥及梗死面積，這可能是通過炎癥分子通路對(duì)其發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：卒中；高尿酸血癥；腫瘤壞死因子α

缺血性腦卒中（IschemicStroke，IS）是一種全球范圍內(nèi)的高危促死亡疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在腦卒中疾病診斷中，高達(dá)80％的病例屬于缺血性腦卒中［1］。該疾病的主要病因是血栓導(dǎo)致腦動(dòng)脈血管閉塞。腦血管的循環(huán)受阻引起氧供量和能量攝取下降，從而導(dǎo)致活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）和促炎癥分子表達(dá)水平上升而引起梗死［2］。盡管梗死是不可逆腦組織損傷，但科學(xué)家發(fā)現(xiàn)選擇合適的藥物和可行性物理治療方法對(duì)缺血性半影區(qū)，即圍繞在梗塞中心的腦組織區(qū)域進(jìn)行治療可以緩解缺血性腦卒中癥狀［3］。再灌注是一種治療缺血性腦卒中的有效方法，主要依據(jù)是血栓溶解藥物在重組組織纖維蛋白溶解酶激活劑的作用下能產(chǎn)生靜脈溶栓作用，但其受到治療時(shí)間的限制，比如急性缺血性腦卒中發(fā)生5h后才能治療［4］。研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中與炎癥作用息息相關(guān)［5］。缺血性腦卒中產(chǎn)生的壞死細(xì)胞和碎片殘留會(huì)導(dǎo)致大腦免疫細(xì)胞小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活，從而促進(jìn)炎癥細(xì)胞和黏附分子的表達(dá)［6］。趨化因子刺激炎癥細(xì)胞移位至缺血性半影，而炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的白介素（IL）－6和腫瘤壞死因子（TNF）－α等細(xì)胞毒素分子會(huì)影響交感神經(jīng)系統(tǒng)［7］。選擇蛋白、整聯(lián)蛋白和免疫球蛋白等黏附分子促進(jìn)尿白血球循環(huán)并作用缺血性損傷部位［8］。血小板、內(nèi)表皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和白血球等細(xì)胞間的相互作用會(huì)導(dǎo)致微脈管血栓和免疫細(xì)胞滲透至腦薄壁組織［9］。目前，從炎癥作用方向研究和探索抗免疫或促免疫作用藥物來治療缺血性腦卒中成為一種潛在可行性方案。高尿酸血癥是由于人體內(nèi)尿酸形成過多或排泄過少而引起的代謝紊亂疾病。在亞洲有43．1％的人患有此病［10］。我國(guó)有近10％的人受高尿酸血癥的影響，且發(fā)病人群還在不斷增加［11］。高尿酸血癥是很多疾病的風(fēng)險(xiǎn)因子，比如缺血性腦卒中、痛風(fēng)、高血壓、肥胖癥和糖尿病等。高尿酸表達(dá)會(huì)引起促炎癥細(xì)胞因子的增加，打開核轉(zhuǎn)錄因子（NF）－κB信號(hào)通路，最后導(dǎo)致下丘腦膠質(zhì)增生形成血栓。研究表明，在缺血性腦卒中患者中，血清尿酸代謝異常［12］。本實(shí)驗(yàn)旨在通過研究高尿酸血癥對(duì)缺血性腦卒中的影響及分子機(jī)制，探討從免疫方向治療缺血性腦卒中的潛在意義。

1資料與方法

1．1材料與試劑

ADVIA2400自動(dòng)生化分析儀購(gòu)買自西門子公司，IL－6和TNF－α抗體購(gòu)買自上海銀海圣生物科技有限公司。IL－6酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒和TNF－αELISA試劑盒均購(gòu)買自日本SCETI生物科學(xué)出口有限公司，高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自Thermo公司，氯化四唑（TTC）染液購(gòu)買自上海哈靈生物科技有限公司，瓊脂糖凝膠試劑和硝酸纖維素膜購(gòu)買自ThermoFisher公司。

1．2Wistar雄性大鼠的飼養(yǎng)、處理及分組

175只8周齡Wistar雄性大鼠購(gòu)買自上海中科院動(dòng)物所。Wistar大鼠飼養(yǎng)在SPF動(dòng)物房（溫度25℃；濕度60％），光照周期12h／12h，自由攝取食物和水。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建前12h禁食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依照國(guó)家研究所關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用健康指導(dǎo)。將Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組（n＝35），MCAO對(duì)照組（n＝35），MCAO＋All（10mg）組（n＝35），MCAO＋All（20mg）組（n＝35），MCAO＋All（30mg）組（n＝35）。MCAO模型的構(gòu)建采用線栓法，鑒定采用BedersonJB5分分級(jí)法。對(duì)MCAO＋All3組大鼠進(jìn)行別嘌呤醇不同給藥濃度（10mg•kg－1•d－1，20mg•kg－1•d－1，30mg•kg－1•d－1，溶于飲用水）處理2周，空白對(duì)照組不做任何處理，MCAO組僅采用殘栓法構(gòu)建MCAO模型。

1．3大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型構(gòu)建

用線栓法對(duì)Wistar雄性大鼠進(jìn)行手術(shù)構(gòu)建MCAO模型，手術(shù)時(shí)燈光照明并酒精燈加熱保證大鼠37℃體溫。用10％水合氯醛（V／W：0．35ml／100mg）腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，正中切開頸部并暴露頸總動(dòng)脈（commoncarotidartery，CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（internalcarotidartery，ICA）和頸外動(dòng)脈（externalcarotidartery，ECA），對(duì)ECA和CCA進(jìn)行結(jié)阻。然后在閉塞ICA（阻止流血）的條件下將消毒尼龍線插入至大腦中動(dòng)脈阻塞該部位的血液循環(huán)形成大腦中動(dòng)脈閉塞。4h后麻醉大鼠并切斷外露尼龍線并進(jìn)行縫合完成手術(shù)。

1．4血清尿酸水平及IL－1β和TNF－α水平檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)開始前對(duì)大鼠禁食12h，麻醉后快速抽取空白對(duì)照組和MCAO對(duì)照組心臟血10ml，其他3組各5ml。用ADVIA2400自動(dòng)生化分析儀測(cè)定空白對(duì)照組和MCAO對(duì)照組血清尿酸（各5ml血樣）；剩余血樣離心收集上液血清保存于－80℃冰箱。用ELISA試劑盒對(duì)血清中的IL－6和TNF－α進(jìn)行檢測(cè)。具體步驟：將－80℃保存的樣品和試劑盒平衡至室溫25℃；IL－6和TNF－α抗體分別包被于微板上；分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和空白對(duì)照；再依次加入辣根過氧化物酶孵育；最后加酶底物顯色測(cè)450nm光密度OD值。做標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算IL－6和TNF－α的含量。

1．5Westernblotting檢測(cè)IL－6和TNF－α蛋白表達(dá)

用斷頭法處死大鼠并取大腦中段組織2mm，剪碎后用勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿處理，往細(xì)胞中加入裂解液，20000g4℃離心0．5h得到總蛋白。參照操作說明對(duì)樣品進(jìn)行SDS－PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂、一抗孵育、二抗孵育處理，最后顯色并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行蛋白半定量分析。

1．6腦組織TTC染色

采用TTC染色缺血性腦卒中梗塞組織。TTC是一種光敏感脂溶性復(fù)合物，活組織或細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶可以將其還原為著紅色的1，3，5－三苯甲臢（1，3，5－triphenylformazan，TPF），而死組織或細(xì)胞則不著色。對(duì)再灌注分離得到的腦組織進(jìn)行－20℃半小時(shí)處理，然后切成薄片置于無菌的2mm薄片上，將切片放入0．05％TTC溶液中（TTC／磷酸鹽緩沖溶液），37℃孵育半小時(shí)，觀察并拍照。

1．7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（珚x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。多組數(shù)據(jù)采用F檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1血清尿酸、IL－6和TNF－α水平

MCAO對(duì)照組血清中的尿酸水平明顯高于空白對(duì)照組（P＝0．001）。MCAO對(duì)照組血清IL－6和TNF－α水平均明顯高于空白對(duì)照組（P均＜0．01），在血清IL－6和TNF－α水平比較中，MCAO＋All（10mg）均顯著低于MCAO對(duì)照組，MCAO＋All（20mg）均顯著低于MCAO＋All（10mg），但MCAO＋All（30mg）均顯著高于MCAO＋All（20mg），P＜0．05或＜0．01。

2．2腦組織中IL－6和TNF－α的表達(dá)

MCAO對(duì)照組、MCAO＋All（10mg），MCAO＋All（20mg）和MCAO＋All（30mg）組腦組織中IL－6和TNF－α蛋白表達(dá)水平均明顯高于空白對(duì)照組；IL－6和TNF－α的表達(dá)值比較中，MCAO對(duì)照組均高于空白對(duì)照組，MCAO＋All（10mg）均顯著低于MCAO對(duì)照組，MCAO＋All（20mg）均顯著低于MCAO＋All（10mg），MCAO＋All（30mg）均顯著高于MCAO＋All（20mg），P＜0．05或＜0．01。IL－6和TNF－α蛋白表達(dá)結(jié)果與血清中兩者的含量水平檢測(cè)結(jié)果相符。2．3腦組織TTC染色在MCAO對(duì)照組中，MCAO＋All（10mg），MCAO＋All（20mg）和MCAO＋All（30mg）組中均發(fā)現(xiàn)大腦組織蒼白區(qū)域，顯示TTC（＋），而在空白對(duì)照組中未有蒼白區(qū)域顯示，結(jié)果為TTC（－）。與MCAO對(duì)照組比較，MCAO＋All（10mg），MCAO＋All（20mg）和MCAO＋All（30mg）組中蒼白區(qū)域明顯減少；MCAO＋All（10mg）較MCAO明顯減少；MCAO＋All（20mg）較MCAO＋All（10mg）明顯減少；MCAO＋All（30mg）較MCAO＋All（20mg）明顯增加（P均＝0．001）。

3討論

缺血性腦卒中是一種發(fā)生率極高的心腦血管疾病。從心臟和肺運(yùn)輸氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)大腦的運(yùn)作并帶走二氧化碳和細(xì)胞內(nèi)廢物是腦動(dòng)脈循環(huán)的主要工作，而此過程受阻極易快速發(fā)生缺血性腦卒中，甚至導(dǎo)致死亡。缺血性腦卒中可由多種疾病引起［13］。動(dòng)脈粥樣硬化和膽固醇持續(xù)沉淀會(huì)引起該病的發(fā)生［14］。頸部或腦部的動(dòng)脈縮小會(huì)導(dǎo)致血細(xì)胞形成血結(jié)，而血結(jié)阻塞動(dòng)脈形成血栓，或者被腦周圍動(dòng)脈捕獲形成栓塞。心臟血結(jié)也會(huì)引起缺血性腦卒中而導(dǎo)致心臟病和心臟膜瓣異常等心臟問題［15］。缺血性腦卒中會(huì)引起患者體內(nèi)各種生理指標(biāo)的變化，其中血清尿酸是一個(gè)明顯的變化因子，且其含量升高［16］。細(xì)胞死亡、酒精攝取過量、腎功能受損和利尿劑的使用都會(huì)導(dǎo)致血清尿酸含量升高［17］。高血清尿酸是缺血性腦卒中的一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因子。本實(shí)驗(yàn)中，在缺血性腦卒中患者中檢測(cè)到高含量的血清尿酸。別嘌呤醇（Allopurinol）是治療高尿酸血癥的有效藥物。次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下會(huì)形成黃嘌呤，進(jìn)而生成尿酸。別嘌呤醇通過抑制黃嘌呤氧化酶來抑制尿酸的形成。促炎癥細(xì)胞因子與尿酸呈正相關(guān)，且高血清尿酸會(huì)引起炎癥［18］。在缺血性腦卒中癥中，炎癥作用包括四個(gè)過程：免疫細(xì)胞進(jìn)入缺血性腦組織；免疫細(xì)胞的進(jìn)入、腦水腫和出血對(duì)血腦屏障破壞；白血球損傷缺血性腦組織；巨噬細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞作用［19］。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥的媒介細(xì)胞因子IL－1、IL－6、IL－10、TNF－α和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）－β均有參與炎癥作用過程［20］，且在缺血性腦卒中患者中IL－1和TNF－α水平明顯升高，而IL－6水平呈現(xiàn)不穩(wěn)定性［21］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IL－6和TNF－α水平在大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型中均明顯升高，且通過對(duì)高血清尿酸的抑制治療，發(fā)現(xiàn)IL－6和TNF－α水平均有所下降。綜上所述，高尿酸血癥對(duì)缺血性腦卒中有明顯影響作用，其作用機(jī)制可能與炎癥通路相關(guān)。但對(duì)高尿酸血癥在缺血性腦卒中中起到一個(gè)獨(dú)立的風(fēng)險(xiǎn)因子作用的論斷還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探討。

參考文獻(xiàn)：

［16］謝帆．BMSCs移植對(duì)缺血性腦卒中大鼠IL－1β、TNF－a表達(dá)的影響［D］．衡陽：南華大學(xué)，2014．

作者：蔣娟莉