高尿酸血癥對缺血性腦卒中的作用范文

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摘要：目的：探討高尿酸血癥對缺血性腦卒中的影響。方法：175只Wistar大鼠，分為空白對照組（35只，不做任何處理）和大腦中動脈閉塞（MCAO）組（140只），MCAO組又根據是否給予及給予抗高尿酸藥物別嘌呤醇（All）濃度不同分為：MCAO對照組（35只）、MCAO＋All（10mg）組（35只）、MCAO＋All（20mg）組（35只）和MCAO＋All（30mg）組（35只）；測定比較各組大鼠血清及腦組織中尿酸、IL－6和TNF－α水平及蛋白表達，以及腦梗死面積。結果：MCAO組血清尿酸水平顯著高于空白對照組［（90．38±31．27）mmol／L比（56．26±8．82）mmol／L］，P＝0．001。與MCAO對照組比較，MCAO＋All10mg，20mg和30mg組中血清及腦組織中IL－6［血清：（25．63±0．7）ng／L比（23．52±0．6）ng／L、（18．33±0．9）ng／L、（20．11±0．8）ng／L，腦組織：（1．20±0．32）ng／L比（0．98±0．26）ng／L、（0．64±0．34）ng／L、（0．87±0．16）ng／L］和TNF－α［血清：（200．42±8．2）ng／L比（184．37±6．2）ng／L、（165．75±6．8）ng／L、（171．25±7．5）ng／L，腦組織：（2．41±0．6）ng／L比（2．12±0．2）ng／L、（1．62±0．8）ng／L、（1．77±0．5）ng／L］水平和蛋白表達均明顯降低，腦梗死面積［（48．42±6．2）％比（40．25±3．1）％、（10．48±4．2）％、（22．42±5．2）％］均明顯縮?。磺襇CAO＋All（20mg）組的血清及腦組織中IL－6和TNF－α水平及蛋白表達最低，腦梗死面積最?。≒＜0．05或＜0．01）。結論：缺血性腦卒中大鼠尿酸水平明顯升高，抑制尿酸水平可改善炎癥及梗死面積，這可能是通過炎癥分子通路對其發揮作用。

關鍵詞：卒中；高尿酸血癥；腫瘤壞死因子α

缺血性腦卒中（IschemicStroke，IS）是一種全球范圍內的高危促死亡疾病。據統計，在腦卒中疾病診斷中，高達80％的病例屬于缺血性腦卒中［1］。該疾病的主要病因是血栓導致腦動脈血管閉塞。腦血管的循環受阻引起氧供量和能量攝取下降，從而導致活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）和促炎癥分子表達水平上升而引起梗死［2］。盡管梗死是不可逆腦組織損傷，但科學家發現選擇合適的藥物和可行性物理治療方法對缺血性半影區，即圍繞在梗塞中心的腦組織區域進行治療可以緩解缺血性腦卒中癥狀［3］。再灌注是一種治療缺血性腦卒中的有效方法，主要依據是血栓溶解藥物在重組組織纖維蛋白溶解酶激活劑的作用下能產生靜脈溶栓作用，但其受到治療時間的限制，比如急性缺血性腦卒中發生5h后才能治療［4］。研究發現，缺血性腦卒中與炎癥作用息息相關［5］。缺血性腦卒中產生的壞死細胞和碎片殘留會導致大腦免疫細胞小神經膠質細胞激活，從而促進炎癥細胞和黏附分子的表達［6］。趨化因子刺激炎癥細胞移位至缺血性半影，而炎癥細胞產生的白介素（IL）－6和腫瘤壞死因子（TNF）－α等細胞毒素分子會影響交感神經系統［7］。選擇蛋白、整聯蛋白和免疫球蛋白等黏附分子促進尿白血球循環并作用缺血性損傷部位［8］。血小板、內表皮細胞、淋巴細胞和白血球等細胞間的相互作用會導致微脈管血栓和免疫細胞滲透至腦薄壁組織［9］。目前，從炎癥作用方向研究和探索抗免疫或促免疫作用藥物來治療缺血性腦卒中成為一種潛在可行性方案。高尿酸血癥是由于人體內尿酸形成過多或排泄過少而引起的代謝紊亂疾病。在亞洲有43．1％的人患有此?。?0］。我國有近10％的人受高尿酸血癥的影響，且發病人群還在不斷增加［11］。高尿酸血癥是很多疾病的風險因子，比如缺血性腦卒中、痛風、高血壓、肥胖癥和糖尿病等。高尿酸表達會引起促炎癥細胞因子的增加，打開核轉錄因子（NF）－κB信號通路，最后導致下丘腦膠質增生形成血栓。研究表明，在缺血性腦卒中患者中，血清尿酸代謝異常［12］。本實驗旨在通過研究高尿酸血癥對缺血性腦卒中的影響及分子機制，探討從免疫方向治療缺血性腦卒中的潛在意義。

1資料與方法

1．1材料與試劑

ADVIA2400自動生化分析儀購買自西門子公司，IL－6和TNF－α抗體購買自上海銀海圣生物科技有限公司。IL－6酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒和TNF－αELISA試劑盒均購買自日本SCETI生物科學出口有限公司，高速冷凍離心機購自Thermo公司，氯化四唑（TTC）染液購買自上海哈靈生物科技有限公司，瓊脂糖凝膠試劑和硝酸纖維素膜購買自ThermoFisher公司。

1．2Wistar雄性大鼠的飼養、處理及分組

175只8周齡Wistar雄性大鼠購買自上海中科院動物所。Wistar大鼠飼養在SPF動物房（溫度25℃；濕度60％），光照周期12h／12h，自由攝取食物和水。在進行實驗模型構建前12h禁食。動物實驗依照國家研究所關于實驗動物護理和使用健康指導。將Wistar雄性大鼠隨機分為5組：空白對照組（n＝35），MCAO對照組（n＝35），MCAO＋All（10mg）組（n＝35），MCAO＋All（20mg）組（n＝35），MCAO＋All（30mg）組（n＝35）。MCAO模型的構建采用線栓法，鑒定采用BedersonJB5分分級法。對MCAO＋All3組大鼠進行別嘌呤醇不同給藥濃度（10mg•kg－1•d－1，20mg•kg－1•d－1，30mg•kg－1•d－1，溶于飲用水）處理2周，空白對照組不做任何處理，MCAO組僅采用殘栓法構建MCAO模型。

1．3大鼠大腦中動脈閉塞模型構建

用線栓法對Wistar雄性大鼠進行手術構建MCAO模型，手術時燈光照明并酒精燈加熱保證大鼠37℃體溫。用10％水合氯醛（V／W：0．35ml／100mg）腹腔內注射麻醉大鼠，正中切開頸部并暴露頸總動脈（commoncarotidartery，CCA）、頸內動脈（internalcarotidartery，ICA）和頸外動脈（externalcarotidartery，ECA），對ECA和CCA進行結阻。然后在閉塞ICA（阻止流血）的條件下將消毒尼龍線插入至大腦中動脈阻塞該部位的血液循環形成大腦中動脈閉塞。4h后麻醉大鼠并切斷外露尼龍線并進行縫合完成手術。

1．4血清尿酸水平及IL－1β和TNF－α水平檢測

實驗開始前對大鼠禁食12h，麻醉后快速抽取空白對照組和MCAO對照組心臟血10ml，其他3組各5ml。用ADVIA2400自動生化分析儀測定空白對照組和MCAO對照組血清尿酸（各5ml血樣）；剩余血樣離心收集上液血清保存于－80℃冰箱。用ELISA試劑盒對血清中的IL－6和TNF－α進行檢測。具體步驟：將－80℃保存的樣品和試劑盒平衡至室溫25℃；IL－6和TNF－α抗體分別包被于微板上；分別加入標準品、樣品和空白對照；再依次加入辣根過氧化物酶孵育；最后加酶底物顯色測450nm光密度OD值。做標準曲線并計算IL－6和TNF－α的含量。

1．5Westernblotting檢測IL－6和TNF－α蛋白表達

用斷頭法處死大鼠并取大腦中段組織2mm，剪碎后用勻漿機進行勻漿處理，往細胞中加入裂解液，20000g4℃離心0．5h得到總蛋白。參照操作說明對樣品進行SDS－PAGE電泳、轉膜、脫脂、一抗孵育、二抗孵育處理，最后顯色并用凝膠成像系統進行蛋白半定量分析。

1．6腦組織TTC染色

采用TTC染色缺血性腦卒中梗塞組織。TTC是一種光敏感脂溶性復合物，活組織或細胞內的脫氫酶可以將其還原為著紅色的1，3，5－三苯甲臢（1，3，5－triphenylformazan，TPF），而死組織或細胞則不著色。對再灌注分離得到的腦組織進行－20℃半小時處理，然后切成薄片置于無菌的2mm薄片上，將切片放入0．05％TTC溶液中（TTC／磷酸鹽緩沖溶液），37℃孵育半小時，觀察并拍照。

1．7統計學方法

采用SPSS17軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（珚x±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料以百分率表示，比較采用χ2檢驗。多組數據采用F檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

2結果

2．1血清尿酸、IL－6和TNF－α水平

MCAO對照組血清中的尿酸水平明顯高于空白對照組（P＝0．001）。MCAO對照組血清IL－6和TNF－α水平均明顯高于空白對照組（P均＜0．01），在血清IL－6和TNF－α水平比較中，MCAO＋All（10mg）均顯著低于MCAO對照組，MCAO＋All（20mg）均顯著低于MCAO＋All（10mg），但MCAO＋All（30mg）均顯著高于MCAO＋All（20mg），P＜0．05或＜0．01。

2．2腦組織中IL－6和TNF－α的表達

MCAO對照組、MCAO＋All（10mg），MCAO＋All（20mg）和MCAO＋All（30mg）組腦組織中IL－6和TNF－α蛋白表達水平均明顯高于空白對照組；IL－6和TNF－α的表達值比較中，MCAO對照組均高于空白對照組，MCAO＋All（10mg）均顯著低于MCAO對照組，MCAO＋All（20mg）均顯著低于MCAO＋All（10mg），MCAO＋All（30mg）均顯著高于MCAO＋All（20mg），P＜0．05或＜0．01。IL－6和TNF－α蛋白表達結果與血清中兩者的含量水平檢測結果相符。2．3腦組織TTC染色在MCAO對照組中，MCAO＋All（10mg），MCAO＋All（20mg）和MCAO＋All（30mg）組中均發現大腦組織蒼白區域，顯示TTC（＋），而在空白對照組中未有蒼白區域顯示，結果為TTC（－）。與MCAO對照組比較，MCAO＋All（10mg），MCAO＋All（20mg）和MCAO＋All（30mg）組中蒼白區域明顯減少；MCAO＋All（10mg）較MCAO明顯減少；MCAO＋All（20mg）較MCAO＋All（10mg）明顯減少；MCAO＋All（30mg）較MCAO＋All（20mg）明顯增加（P均＝0．001）。

3討論

缺血性腦卒中是一種發生率極高的心腦血管疾病。從心臟和肺運輸氧氣和營養物質供應大腦的運作并帶走二氧化碳和細胞內廢物是腦動脈循環的主要工作，而此過程受阻極易快速發生缺血性腦卒中，甚至導致死亡。缺血性腦卒中可由多種疾病引起［13］。動脈粥樣硬化和膽固醇持續沉淀會引起該病的發生［14］。頸部或腦部的動脈縮小會導致血細胞形成血結，而血結阻塞動脈形成血栓，或者被腦周圍動脈捕獲形成栓塞。心臟血結也會引起缺血性腦卒中而導致心臟病和心臟膜瓣異常等心臟問題［15］。缺血性腦卒中會引起患者體內各種生理指標的變化，其中血清尿酸是一個明顯的變化因子，且其含量升高［16］。細胞死亡、酒精攝取過量、腎功能受損和利尿劑的使用都會導致血清尿酸含量升高［17］。高血清尿酸是缺血性腦卒中的一個風險因子。本實驗中，在缺血性腦卒中患者中檢測到高含量的血清尿酸。別嘌呤醇（Allopurinol）是治療高尿酸血癥的有效藥物。次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下會形成黃嘌呤，進而生成尿酸。別嘌呤醇通過抑制黃嘌呤氧化酶來抑制尿酸的形成。促炎癥細胞因子與尿酸呈正相關，且高血清尿酸會引起炎癥［18］。在缺血性腦卒中癥中，炎癥作用包括四個過程：免疫細胞進入缺血性腦組織；免疫細胞的進入、腦水腫和出血對血腦屏障破壞；白血球損傷缺血性腦組織；巨噬細胞和星形膠質細胞作用［19］。研究發現，炎癥的媒介細胞因子IL－1、IL－6、IL－10、TNF－α和轉化生長因子（TGF）－β均有參與炎癥作用過程［20］，且在缺血性腦卒中患者中IL－1和TNF－α水平明顯升高，而IL－6水平呈現不穩定性［21］。本實驗結果表明，IL－6和TNF－α水平在大鼠大腦中動脈閉塞模型中均明顯升高，且通過對高血清尿酸的抑制治療，發現IL－6和TNF－α水平均有所下降。綜上所述，高尿酸血癥對缺血性腦卒中有明顯影響作用，其作用機制可能與炎癥通路相關。但對高尿酸血癥在缺血性腦卒中中起到一個獨立的風險因子作用的論斷還需要進一步的實驗探討。

參考文獻：

［16］謝帆．BMSCs移植對缺血性腦卒中大鼠IL－1β、TNF－a表達的影響［D］．衡陽：南華大學，2014．

作者：蔣娟莉