腺樣囊性癌增殖抑制研究范文
本站小編為你精心準(zhǔn)備了腺樣囊性癌增殖抑制研究參考范文，愿這些范文能點(diǎn)燃您思維的火花，激發(fā)您的寫(xiě)作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。
《安徽醫(yī)藥雜志》2016年第11期
摘要：
目的探討脂質(zhì)體和厚樸酚聯(lián)合熱療對(duì)人腺樣囊性癌腫瘤模型的增殖抑制作用。方法用DOTAP：Chol脂質(zhì)體包裹和厚樸酚來(lái)進(jìn)行抗腫瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)；構(gòu)建小鼠人腺樣囊性癌腫瘤模型，瘤內(nèi)注射和厚樸酚并聯(lián)合局部熱療，觀察腫瘤大小及小鼠生存期及生長(zhǎng)狀態(tài)，對(duì)移植瘤進(jìn)行CD31免疫組化染色和TUNEL分析。結(jié)果脂質(zhì)體和厚樸酚聯(lián)合熱療的抗腫瘤效應(yīng)更強(qiáng)，聯(lián)合治療組腫瘤的體積明顯小于對(duì)照組、熱療組、和厚樸酚組（P＜0．05），部分腫瘤完全消退。聯(lián)合治療組小鼠的生存期有明顯獲益（P＜0．05），在殘存腫瘤中，腫瘤組織內(nèi)微血管密度低于其他組，凋亡細(xì)胞明顯增多。結(jié)論脂質(zhì)體和厚樸酚能明顯抑制人腺樣囊性癌增殖，與熱療聯(lián)合能夠增強(qiáng)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生更強(qiáng)腫瘤殺傷效應(yīng)。
關(guān)鍵詞：
囊腺癌；高溫，誘發(fā)；脂質(zhì)體；厚樸酚；細(xì)胞凋亡
腺樣囊性癌是淚腺上皮性腫瘤中最為常見(jiàn)并且惡性程度最高的腫瘤，其發(fā)生率居于第2位，僅次于多形性腺瘤。具有極強(qiáng)的侵襲性，早期即可侵犯血管和神經(jīng)，而且還易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，以肺轉(zhuǎn)移最為常見(jiàn)，轉(zhuǎn)移率高達(dá)40％。目前臨床對(duì)于ACC的治療主要采取手術(shù)聯(lián)合放療，但遠(yuǎn)期療效仍不甚理想［1］。和厚樸酚是從木蘭科木蘭屬植物厚樸的根皮和枝皮中提取的小分子化合物。有研究表明其具有抗炎［2］、抗血栓［3］、抗氧化［4］、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞毒作用［5］等作用。其中一種機(jī)制為和厚樸酚還可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧自由基（ROS），激活細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)通路，上調(diào)表達(dá)蛋白JNK、P38、ERK（P42／P44）水平以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡［4］，同時(shí)和厚樸酚促使細(xì)胞停滯在G1期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［5］。然而和厚樸酚的水溶性極低，正常給藥后血藥濃度很低，從而限制了它的臨床應(yīng)用。在本課題組前期研究中，我們制備得到PEGPE修飾的脂質(zhì)體和厚樸酚。實(shí)驗(yàn)證明，PEGPE修飾的脂質(zhì)體和厚樸酚顯著改善了和厚樸酚的溶解性和在血漿中的藥物濃度，延長(zhǎng)了它的半衰期［6］。本研究旨在觀察脂質(zhì)體和厚樸酚對(duì)小鼠腺樣囊性移植瘤的治療作用及其聯(lián)合熱療的療效。
1材料與方法
1．1試劑與儀器
和厚樸酚（HNK99．99％純度）購(gòu)自上海純優(yōu)生物科技有限公司，二甲基亞砜購(gòu)自Sigma公司，PEGPE修飾的脂質(zhì)體由四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合成；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購(gòu)自杭州四季青公司。大鼠抗小鼠CD31單克隆抗體：購(gòu)自BDPharmingen公司；原位TUNEL檢測(cè)試劑盒：購(gòu)自Promega公司；熒光倒置顯微鏡為日本尼康公司。腺樣囊性癌ACC2細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所，BALB／c小鼠購(gòu)自南京君科生物工程有限公司，動(dòng)物使用許可證號(hào)WCCSIBD2011029。
1．2細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物腫瘤模型的建立
腺樣囊性癌ACC2細(xì)胞株用RPMI1640培養(yǎng)基（含10％胎牛血清）于37℃，5％CO2條件下傳代培養(yǎng)。動(dòng)物模型參考文獻(xiàn)建立［7］。采用6～8周齡、20g左右的BALB／c雌性小鼠，SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，將ACC2細(xì)胞接種到小鼠右后肢外側(cè)皮下，每只接種5×105～1×106個(gè)細(xì)胞（0．1mL）。
1．3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理
將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、熱療組、和厚樸酚組、和厚樸酚＋熱療組，每組10只，采用尾靜脈注射給藥的方式在每4天治療一次，生理鹽水、脂質(zhì)體和厚樸酚分別為100μL、50μg。局部水浴熱療42℃，每天1h。療程結(jié)束后處死小鼠后取腫瘤組織，固定、切片，按TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)操作染色，熒光顯微鏡下觀察。
1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
應(yīng)用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。觀測(cè)數(shù)據(jù)主要為計(jì)量資料，以x±s表示，多組間的比較采用單因素方差分析。多組多時(shí)點(diǎn)觀測(cè)資料則采用兩因素重復(fù)測(cè)量分析或兩因素析因分析。荷瘤小鼠不同治療的生存資料比較為KaplanMeier乘積限法＋Logrank檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
2．1荷瘤小鼠移植瘤生長(zhǎng)情況及瘤體的變化趨勢(shì)
將ACC2細(xì)胞接種到小鼠右后肢外側(cè)皮下，每只接種1×106個(gè)細(xì)胞（0．1mL），腫瘤體積測(cè)定按照Steel經(jīng)驗(yàn)公式：腫瘤體積（mm3）＝π／6×長(zhǎng)×寬2，長(zhǎng)：腫瘤最長(zhǎng)徑，寬：腫瘤最短經(jīng)。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到200mm3時(shí)，開(kāi)始給藥。開(kāi)始治療1月后，聯(lián)合治療組腫瘤生長(zhǎng)最緩慢，甚至有1只小鼠腫瘤完全消退。從圖中可以看出單藥和厚樸酚或局部熱療可以抑制腫瘤生長(zhǎng)，但聯(lián)合治療可以發(fā)揮更強(qiáng)的作用（圖1），進(jìn)一步進(jìn)行兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析發(fā)現(xiàn)：4個(gè)治療組間（F分組，P分別為：25．68，0．000）、各時(shí)點(diǎn)間（F時(shí)間，P分別為：554．21，0．000）、組和時(shí)間的交互作用（F交互，P分別為：60．770．000）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），提示腫瘤體積在組間、時(shí)點(diǎn)間的變化很大，且隨時(shí)間的變化趨勢(shì)受分組影響。熱療組對(duì)比HNK組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。
2．2荷瘤小鼠不同治療的生存時(shí)間比較
在腺樣囊性癌ACC2小鼠腫瘤模型中，聯(lián)合治療小鼠有明顯生存獲益，聯(lián)合治療組中位生存期達(dá)42．3d，而生理鹽水組為14．5d，熱療組為36．6d，厚樸酚組均為37．9d。KaplanMeier生存分析及l(fā)ogrank檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療組的生存期明顯優(yōu)于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝27．90，P＜0．05）（圖2）。
2．3不良反應(yīng)觀察
隨著腫瘤逐漸增大及化療藥物使用，各組荷瘤鼠攝食均出現(xiàn)減少，活動(dòng)逐漸遲緩，精神狀態(tài)變差，體質(zhì)量減輕。后期出現(xiàn)腫瘤惡病質(zhì)表現(xiàn)，甚至死亡。處死小鼠后取重要臟器進(jìn)行大體及顯微鏡下觀察，聯(lián)合治療組與對(duì)照組均未見(jiàn)發(fā)現(xiàn)明顯的異常（圖3）。
2．4免疫組化染色檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)微血管密度
取腫瘤組織石蠟切片，采用CD31單抗做腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫組化染色后顯微鏡下觀察（圖4），200倍光鏡下，每組切片拍攝5個(gè)陽(yáng)性視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)微血管數(shù)，計(jì)算平均微血管數(shù)作為腫瘤組織內(nèi)微血管密度（MVD），各組微血管密度分別為生理鹽水對(duì)照組26．7％±5．5％、熱療組18．3％±4．6％、和厚樸酚組24．6％±6．5％、聯(lián)合治療組13．5％±4．7％。聯(lián)合治療組腫瘤組織內(nèi)微血管密度顯著低于其他三組（F＝5．63，P＜0．05）。（圖5）。
2．5原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)移植瘤內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù)
取腫瘤組織石蠟切片，用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒染色后熒光顯微鏡下觀察（圖6），每組切片拍攝6個(gè)陽(yáng)性視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算平均凋亡細(xì)胞數(shù)所占百分比作為凋亡指數(shù)。各組凋亡指數(shù)分別為生理鹽水組6．7％±0．5％、熱療組38．3％±0．6％、和厚樸酚組34．8％±0．5％、聯(lián)合治療組55．6％±4．8％。聯(lián)合治療組腫瘤凋亡指數(shù)顯著高于其他三組（F＝251．57，P＜0．05）。見(jiàn)圖7。
3討論
腺樣囊性癌是一種少見(jiàn)的腫瘤類(lèi)型，多發(fā)生于頭頸部，尤其是涎腺區(qū)，也有發(fā)生于乳腺、淚腺、支氣管的報(bào)導(dǎo)。腺樣囊性癌是涎腺第三大常見(jiàn)腫瘤，治療首選根治性手術(shù)切除，然而頭頸部解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且腫瘤極易延神經(jīng)蔓延，導(dǎo)致手術(shù)難以根治，術(shù)后常需進(jìn)行輔助放療，化療療效有限，僅用于晚期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，因此亟需開(kāi)發(fā)更為有效的治療性藥物。
和厚樸酚是天然植物厚樸的皮中提取的一種化合物，氣味辛香，具有獨(dú)特的物理特性，能夠穿過(guò)血腦屏障，中醫(yī)認(rèn)為其具有化濕導(dǎo)滯的作用。有研究表明，和厚樸酚還具有抗癌作用，可體外誘導(dǎo)結(jié)黑色素瘤、骨肉瘤、腸癌和肝癌等腫瘤細(xì)胞凋亡［8－11］。和厚樸酚可抑制Akt磷酸化，調(diào)節(jié)核生長(zhǎng)因子NFкB激活，進(jìn)一步調(diào)控VEGF、MCL1、COX2等蛋白，從而誘導(dǎo)凋亡［12］。另外，和厚樸酚還能誘導(dǎo)caspase介導(dǎo)的凋亡途徑［13］，在p53缺失時(shí)，和厚樸酚通過(guò)激活caspas3、7、9而激活外源性凋亡途徑，p53存在時(shí)，還可通過(guò)內(nèi)源性途徑啟動(dòng)凋亡程序，這一途徑在各腫瘤細(xì)胞系中更為常見(jiàn)和廣泛。
熱療是繼手術(shù)、放療、化療及生物治療后又一腫瘤治療手段，由于其不良反應(yīng)小，已經(jīng)被越來(lái)越多的臨床工作者所重視［14－15］。不少?lài)?guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了研究與闡明，文獻(xiàn)顯示熱療能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［15］增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療敏感性［16］減輕患者的放化療期間不良反應(yīng)［17］。熱療還能使細(xì)胞VEGF的表達(dá)受抑制，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)高溫作用后可產(chǎn)生熱休克蛋白其能夠激活機(jī)體的免疫功能，產(chǎn)生針對(duì)自身腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞因子［16］。
在我們的研究中，單藥脂質(zhì)體和厚樸酚或單純熱療均能產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)，然而聯(lián)合治療組腫瘤生長(zhǎng)更慢，小鼠生存期更長(zhǎng)，腫瘤組織內(nèi)微血管密度更低，TUNEL染色可見(jiàn)更多凋亡細(xì)胞。目前熱療已廣泛用于臨床，具有很好的療效，體外研究證明熱療具有促進(jìn)藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞和誘導(dǎo)的凋亡的作用，而和厚樸酚可誘導(dǎo)Caspase介導(dǎo)的凋亡途徑［18］。熱療增加脂質(zhì)體和厚樸酚的抗腫瘤作用，其具體機(jī)制可能是：兩種治療從不同位點(diǎn)激活Caspase途徑，產(chǎn)生協(xié)同作用從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但真實(shí)的內(nèi)在機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
4結(jié)語(yǔ)
綜上所述，脂質(zhì)體和厚樸酚聯(lián)合熱療治療腺樣囊性癌ACC2荷瘤小鼠，具有好的近期療效和遠(yuǎn)期生存，且無(wú)明顯不良反應(yīng)。熱療能協(xié)同脂質(zhì)體和厚樸酚誘導(dǎo)促進(jìn)腫瘤凋亡，其內(nèi)在機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，但可以預(yù)期，聯(lián)合治療具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。
參考文獻(xiàn):
［15］王濟(jì)東，夏廷毅，焦寶云，等．螺旋斷層放療聯(lián)合熱療治療局部晚期腫瘤或寡轉(zhuǎn)移的療效觀察［J］．山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，46（10）：10301032.
作者:王冠杰 趙婭娟 董濟(jì)民 單位:西安市中心醫(yī)院