水稻類病斑突變系的培育范文

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《核農學報》2016年第六期

摘要:

利用γ射線輻照水稻品種嘉浙B的種子，從處理后代中獲得了穩(wěn)定的類病斑突變體嘉浙DB。為了闡明該突變體性狀形成的遺傳和生物學基礎，開展了突變基因定位和類病斑特征及葉綠體相關特性的研究。結果表明，嘉浙DB是一種典型的Sekiguchi類病斑突變體，在無病原菌侵染和外界脅迫的情況下，葉片上可自發(fā)形成棕黃色病斑，病斑的面積隨著植株的生長不斷擴大;在病斑擴展階段，突變體葉片細胞中葉綠體結構紊亂，提早降解，光合作用效率顯著下降;嘉浙DB的類病斑性狀屬隱性性狀，很可能受LOC_Os12g16720的1個突變等位基因控制，其第1425位核苷酸G缺失可導致移碼突變從而編碼一個截斷的蛋白;突變體中清除活性氧的4個葉綠體抗壞血酸過氧化物酶(APX)的基因轉錄水平在白天光合作用下均顯著高于野生型，而在夜間則無顯著差異。葉綠體的結構紊亂及細胞內的高活性氧含量可能是引發(fā)突變體葉片細胞凋亡的原因。本研究為從葉綠體的角度闡述Sekiguchi類病斑發(fā)生的分子機制提供了依據(jù)。

關鍵詞:

類病斑突變體;Sekiguchi;葉綠體;抗壞血酸過氧化物酶;細胞凋亡

在無病原菌侵染和逆境或損傷侵害時，植物葉片自發(fā)形成的與被病原菌侵染類似的壞死癥狀統(tǒng)稱為類病斑，根據(jù)病斑出現(xiàn)時間和是否擴散，LM可分為起始型和擴散型2類［1］。前者在葉片伸出葉鞘時就已帶有病斑，一般較小，多呈點狀;后者在葉片伸出葉鞘后才出現(xiàn)，斑點面積不斷擴大，多為不規(guī)則形狀，最后斑點間可擴展互連而使整張葉片枯死。目前，通過誘發(fā)突變已獲得了多種突變體，培育了大批優(yōu)良品種，在植物功能基因組學研究中發(fā)揮了重要作用［2－4］。LM突變是水稻中常見的一類突變體，斑點形狀各異［5－7］。其中，Segikuchi突變體是水稻中最早被發(fā)現(xiàn)的一類LM突變體，屬于擴散型LM，可自發(fā)形成，且在接種稻瘟病病原菌或者化學試劑(過氧化氫)處理之后會提前出現(xiàn)［8－9］。同時SekiguchiLM是一種光依賴型類病斑，其形成需要光照誘導［10］。已克隆的水稻LM突變基因編碼不同功能的蛋白，如泛素介導蛋白降解相關蛋白［11］、網(wǎng)格蛋白受體［12］、RNA結合蛋白［13］、RNA選擇性剪接蛋白［14］。Fujiwara等［15］克隆得到控制Sekiguchi病斑的基因，該基因編碼細胞色素P450單加氧酶，可催化色胺轉化為五羥色胺。本研究在γ射線輻射誘變的群體中發(fā)現(xiàn)了1株類病斑突變體，經多代繁殖形成了穩(wěn)定的LM突變系。之后將突變基因定位在1個包含Sekiguchi類病斑突變基因的區(qū)段，確認基因CYP71A1出現(xiàn)了G缺失突變。在此基礎上，對其葉綠體結構、光合作用特性和活性氧清除相關基因表達等開展研究，分析突變體中葉綠體降解的特征及其在細胞凋亡過程中的作用，旨在為進一步闡明類病斑發(fā)生的分子機制提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1LM突變體培育采用350Gy60Co－γ射線誘變處理干種子建立秈稻品種嘉浙B的突變群體。γ射線輻照在浙江大學輻照中心完成，M1種植方法同李瑞清等［16］的報道。在成熟期的M2群體中(約20000株)發(fā)現(xiàn)了1株葉片出現(xiàn)不規(guī)則斑點的變異株。之后在M3和M4群體中繼續(xù)觀察到相同的類病斑性狀，群體內不再分離，從而將其定名為嘉浙B大斑突變體，簡稱嘉浙DB。在分蘗期，分別取嘉浙DB具大斑表型的葉片，與野生型葉片一起進行胎盤藍染色。具體方法為:將葉片浸泡于染液中(30mL乙醇，10g苯酚，10mg胎盤藍，10mL乳酸，10mL甘油，10mL水)，煮沸2～3min，室溫放置2h。然后用2.5mg•mL－1水合氯醛脫色，并保存于50%甘油中。

1.2基因定位為定位大斑突變基因，用嘉浙DB與5個水稻品種(日本晴、浙粳122、嘉911、嘉33和協(xié)青早)雜交，F(xiàn)1自交得到F2群體。在分蘗期，選取攜帶大斑的單株采用CTAB法［16］從葉片中提取基因組DNA。參照Gramene網(wǎng)站相關信息選擇用于定位的微衛(wèi)星標記;同時用洪雋等［17］的方法在定位區(qū)段內設計插入/缺失標記(InDel)，用于突變基因定位(表1)。采用20μLPCR反應體系:2μL基因組DNA(約50ng)、上下游引物(10μmol•L－1)各0.5μL，2×TaqMix10μL，用ddH2O補足20μL。PCR程序設置為:94℃預變性90s;94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán);最后72℃延伸5min。PCR產物在10%聚丙烯酰胺凝膠上分離，銀染法顯示DNA條帶［18］。

1.3葉片顯微結構觀察和光合作用的測量從已經出現(xiàn)LM的嘉浙DB植株中，選取3個不同發(fā)展階段的葉片進行葉綠體顯微結構的觀察，即尚未出現(xiàn)類病斑的葉片(L1)，出現(xiàn)病斑葉片中的非病斑區(qū)域(L2)和病斑區(qū)域(L3)。所取葉片在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定過夜，之后用0.1M磷酸緩沖液(pH值7.0)漂洗3次，每次15min，再用1%鋨酸處理1～2h，磷酸緩沖液清洗后依次用乙醇(50%、70%、80%、90%、95%、100%)梯度脫水，每次15min，最后用純丙酮處理20min。用樹脂包埋劑/丙酮(1∶1和3∶1)分別滲透處理1h和3h后，在純包埋劑中滲透過夜。樣品切成70～90nm薄片，用檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾各染色15min，在透射顯微鏡(HitachiH－7650，日本日立)下觀察超微結構。在下午13點到14點間(光照強度約1000μmolE•m－2•s－1)用光合速率測定儀Yaxin－1101(北京雅欣理儀科技有限公司)測定嘉浙DB的3類病斑不同發(fā)展階段的葉片及對照嘉浙B的凈光合速率，蒸騰速率、氣孔導度、細胞間CO2濃度。

1.4RNA的提取及實時定量PCR在分蘗期，取嘉浙B和嘉浙DB無斑點葉片組織，采用TRIzol試劑提取總RNA。經DNe酶處理后，取500ngRNA用反轉錄試劑盒M-MLV(大連TaKaRa公司)反轉錄成cDNA。采用實時熒光定量PCR對4個葉綠體抗壞血酸過氧化物酶(APX)基因轉錄本豐度進行分析［19］。PCR體系為10μL，含1μLcDNA、0.4μL上下游引物(10μmol•L－1)、5μL2×Mix緩沖液(Mtermix，TOYOBO)，雙蒸水補足10μL。PCR程序為:94℃充分變性2min;94℃變性30s，60℃復性/延伸1min，40個循環(huán)。以管家基因Actin2(LOC_Os19g36650)作為內參基因(表2)，采取2－ΔΔCt方法分析相對表達量［20］。

1.5數(shù)據(jù)分析利用軟件StatView對光合作用及RT-PCR數(shù)據(jù)進行方差(ANOVA)分析，檢測差異顯著性。

2結果與分析

2.1類病斑突變體嘉浙DB的主要特征在幼苗階段(約萌發(fā)后6周內)，嘉浙DB葉片與野生型嘉浙B表現(xiàn)一致，未出現(xiàn)明顯的類病斑。但從分蘗期開始，嘉浙DB完全伸展葉后出現(xiàn)類病斑，隨后病斑擴大逐步形成不規(guī)則的形狀(圖1－A左)。斑點從小到大，至15d時大小已達0.8×1.5cm左右。最后，類病斑相互連在一起直至覆蓋整個葉片，類似枯葉，肉眼可見其大小的變化進程(圖1－B)，長度可達約1.5cm，寬度約0.9cm。通過胎盤藍染色，斑點區(qū)域被染上深重的顏色，染色區(qū)域的大小和形狀與葉片上的病斑區(qū)域一致，說明斑點區(qū)域的細胞已經死亡(圖1－A右)。由于病斑總是在葉片完全伸出后才形成，植株可以正常生殖生長，在植株衰老死亡之前，一定數(shù)量的種子已經成熟，因此不影響突變體的傳代。

2.2類病斑基因定位與分析在嘉浙B和嘉浙DB的雜交F2群體中，葉片出現(xiàn)類病斑與葉片正常植株分別是48株和152株，符合1∶3的分離比(χ2=0.16)，表明嘉浙DB的LM性狀由單隱性基因控制。為了克隆此突變基因，用F2群體中鑒定出來的1685個突變型單株進行基因定位。首先利用微衛(wèi)星標記將突變基因定位在第12號染色體上，介于RM101和RM1795之間;在這2個位點上分別有7個和6個單株表現(xiàn)為雜合型(圖2－A)。在此基礎上，進一步利用InDel標記縮小范圍，將其限定在標記ID22和ID18間約300kb區(qū)段內(圖2－B)。根據(jù)Gramene網(wǎng)站信息，在這一區(qū)域內共有58個基因。除LOC_Os12g16720外，有38個基因注釋為轉座子或者反轉座子基因，其它19個編碼蛋白的基因中，有9個功能未知的蛋白，其余10個基因編碼功能蛋白(表3)。其中，LOC_Os12g16720編碼細胞色素P450蛋白CYP71A1，該基因的突變已被確認為導致了Sekiguchi突變表型［12］。最后將該基因和其它3個候選基因(LOC_Os12g16650，LOC_Os12g16690，LOC_Os12g17090)的全長進行測序。結果表明，嘉浙B和嘉浙DB只在基因LOC_Os12g16720存在差異，突變體的第1425位核苷酸G缺失，理論上將造成移碼突變，而其它3個基因的序列完全一致(圖2－C)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，細胞色素P450蛋白存在一個與卟啉環(huán)結合的結構域核心保守序列FGGGRRGCPG，而1425G缺失引起的移碼突變恰能使這一結構域丟失，從而使蛋白失去功能(圖2－D)。

2.3大斑突變對葉綠體結構和光合作用的影響用透射電鏡對突變體葉片的3種組織(L1、L2、L3)進行觀察，以探究嘉浙DB中葉綠體超微結構的變化。結果表明，野生型植株嘉浙B葉片組織中可見完整的、平行排列的基粒類囊體，基粒之間的基質類囊體也清晰可見(圖3－A、E)，而嘉浙DB葉片組織中，L1基粒已經開始降解，呈圓形，有嗜鋨顆粒出現(xiàn)，表明類囊體片層開始降解(圖3－B、F)。L2基粒的整齊平行排列性消失，輪廓模糊(圖3－C、G)，同時出現(xiàn)了溶酶體和一些囊泡小球。L3細胞已處于混亂狀態(tài)，無明顯的細胞器，細胞結構區(qū)室化消失，即整個細胞完全降解，只剩下細胞壁(圖3－D、G)。為了進一步分析葉綠體的破壞是否會對光合作用造成影響，分別測定了嘉浙B和嘉浙DB葉片的4個光合作用相關參數(shù):凈光合速率(Pn)，蒸騰速率(Tr)、氣孔導度(Gs)、細胞間CO2濃度(Ci)。由圖4可知，與嘉浙B相比，嘉浙DB的葉片組織Pn、Tr和Gs都顯著下降，表明類病斑突變對葉片光合作用具有顯著的負效應。此外，突變體的Ci顯著高于野生型親本，表明CO2在突變體組織中不能被有效同化。在突變體中，L2的光合作用均低于L1，但差異不顯著，表明兩者的內部結構發(fā)生變化，具有漸進性。2.4清除活性氧相關基因的表達為了探明嘉浙DB中葉綠體提早降解是否與活性氧過量有關，通過實時熒光定量PCR分析了4個葉綠體抗壞血酸過氧化物酶APX基因的表達水平。與嘉浙B相比，嘉浙DB的APX基因的轉錄水平在白天顯著提高，而在夜間兩者無差異(圖5)。

3討論

類病斑是一類常見的突變性狀，由于其在植物細胞程序性死亡、超敏反應等在生物學研究中具有獨特的利用價值，該類材料的鑒定和研究一直受到高度重視［21－23］。Fujiawara等［15］曾用EMS誘變獲得3個表型與嘉浙DB相似的類病斑突變體，發(fā)現(xiàn)其分別由LOC_Os12g16720基因的3個突變［G1009A(發(fā)生在內含子區(qū)域，影響基因表達)，C1037T(Thr314Ile)和G1556A(Gly455p)］造成。本研究通過γ射線誘變處理育成了一個Sekiguchi類病斑突變體，基因定位和候選基因分析結果表明，該突變性狀有可能為CYP71A1基因突變所致。由于嘉浙DB突變可使蛋白的保守結構域消失，因此是一份研究CYP71A1及其生物學功能的新的突變體材料。一般認為，線粒體在PCD中發(fā)揮著重要的作用，可以因為膜電位的變化、細胞色素c的釋放等原因引發(fā)細胞質凋亡酶等下游一系列反應，從而促進PCD的發(fā)生［24－25］。在葉綠體光合作用過程中也可以產生大量活性氧(ROS)，它們如果在葉綠體中不能被有效分解，將會破壞脂類物質和蛋白質，造成細胞衰老甚至引起細胞的死亡［26－28］。與呼吸作用電子傳遞鏈一樣，在葉綠體中也存在光合電子傳遞鏈，存在著細胞色素f，因此也可能介導植物發(fā)生PCD［29－30］。已經明確一些類病斑突變體由于葉綠素代謝上存在缺陷可以引起胞凋亡，例如ACD1/ACD2，分別編碼脫鎂葉綠素酸氧化酶和葉紅素還原酶，它們的突變導致葉綠素代謝障礙，從而引起細胞凋亡調節(jié)系統(tǒng)的紊亂［31－32］。雖然已知Sekiguchi類突變體也表現(xiàn)為典型的PCD癥狀，但對引起的原因迄今尚不十分清楚。在本研究中，4個APX基因的轉錄水平在白天顯著高于嘉浙B，表明突變體中的ROS含量很高，因此有可能會促使PCD的發(fā)生。此外，從葉綠體的電鏡照片可以看出，突變體的葉綠體結構出現(xiàn)了損壞，發(fā)現(xiàn)了溶酶體和一些囊泡小球，這些囊泡小球有可能用于運輸葉綠體分解物質，尤其是核酮糖羧化酶，而它們也是細胞死亡的一個重要標志［33－34］。通過亞細胞定位，已經明確CYP71A1是一個內質網(wǎng)蛋白［12］，從而排除了由于其缺失直接引起葉綠體結構紊亂的可能性。因此，葉綠體結構的損壞更有可能是ROS不能及時清除造成的。此外，盡管突變體植株L1組織部位和野生型葉片都表現(xiàn)為綠色無病斑，但前者的光合速率顯著低于后者，說明其葉綠體結構受到損傷，從而影響光合作用。

4結論

本研究獲得了一份Sekiguchi類病斑突變體嘉浙DB，由編碼細胞色素氧化酶CYP71A1的基因LOC_Os12g16720發(fā)生缺失突變引起。該突變體葉綠體結構紊亂，葉綠體提前分解，光合作用下降。編碼APX酶的基因轉錄水平顯著提高，表明突變體無法及時清除葉綠體產生的大量活性氧，從而造成PCD的發(fā)生。

作者：蘆海平 張華麗 富昊偉 李友發(fā) 崔海瑞 舒慶堯 單位：浙江大學原子核農業(yè)科學研究所/農業(yè)部核農學重點開放實驗室 嘉興市農業(yè)科學研究院 浙江大學作物科學研究所