抗生素抗性基因的水環境論文范文

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1抗生素抗性基因在水環境中的來源與污染情況

1.1地表水中的抗性基因污染隨著人類社會的不斷發展，畜牧養殖、污水處理等人類活動對于地表水中抗生素抗性基因污染的影響日益顯著。雖然污水處理廠的處理工藝能夠去除一部分抗性基因，但是仍有大量抗性基因隨出水排入地表水中。近年來，研究人員在江河湖泊等地表水中檢測出大量的抗生素抗性基因。Pruden等[22]檢測出美國南拉普特河從上游至下游中(人類活動呈遞增梯度)sul1抗性基因的含量大幅度增加，深入研究后發現sul1含量與上游河岸的動物養殖廠及污水處理廠數目成正相關。Chen等沿珠江流域至珠江河口(人類活動影響呈遞減梯度分布)檢測江水中的四環素類抗性基因(tetA、tetC、tetH、tetB、tetM、tetO、tetW抗性基因)的含量，發現珠江流域檢測到四環素類抗性基因的頻率與種類都明顯高于珠江河口地區。Ling等在中國南方北江河中檢測出2種磺胺類抗性基因和7種四環素類抗性基因，其中磺胺類抗性基因中sul1的含量比sul2高，其平均值分別為1.41×10-2和1.58×10-3copies•(16SrDNA)-1；四環素類抗性基因中tetG的出現頻率最高(100%)，tetC的含量最高，其濃度在8.30×10-2到13.20copies•(16SrDNA)-1之間變化。Jiang等利用PCR技術在黃浦江中檢測到2種磺胺類抗性基因(sul1、sul2)、8種四環素類抗性基因(tetA、tetB、tetC、tetG、tetM、tetO、tetW、tetX)和1種內酰胺類抗性基因(TEM)，并利用實時定量PCR技術檢測出這11種抗性基因的含量在3.66×101copy•mL-1(tetB)到1.62×105copy•mL-1(sul2)之間變化。Luo等在中國海河中也檢測出磺胺類抗性基因和四環素類抗性基因，同樣，磺胺類抗性基因的檢測頻率與含量都高于四環素類抗性基因。其中，sul1抗性基因含量為(7.8±1.0)×109copies•g-1，sul2抗性基因含量為(1.7±0.2)×1011copies•g-1。Stoll等在德國的萊茵河和澳大利亞的布里斯班河中均檢測出多種抗生素抗性基因，磺胺類抗性基因的檢測頻率最高，其中sul1檢測頻率(98%)稍高于sul2(77%)。在水產養殖業中大量添加的抗生素，一部分不能被魚類吸收而直接排入到水體中，另一部分被魚類吸收后在其體內誘導出抗性菌株，隨糞便排入水體，所以在水產養殖區水體中亦存在大量抗性基因。Gao等在天津地區的水產養殖場中檢測出多種抗性基因(tetM、tetO、tetT、tetW、sul1及sul2)。此外，磺胺甲基惡唑抗性細菌占63.3%，四環素抗性細菌占57.1%，這說明有一部分細菌呈多重抗性。Liang等在魚塘中的大腸桿菌菌群中發現其中91.5%的大腸桿菌都含有抗性基因，86.1%的大腸桿菌含有兩種以上的抗性基因。DiCesare等在地中海沿岸的養魚場中也發現了tetM、tetO、tetL、tetK、ermB、ermA和ermC等多種抗性基因，但該漁場并沒有在飼料中添加任何抗生素，這說明該漁場中的抗性基因可能是由于海水養殖促進了抗性基因的水平轉移。Reboucas等在巴西的一個養蝦場中也發現了對氨芐青霉素和四環素均具有抗性的致病性弧菌。除此之外，在越南、泰國、韓國、印度、埃及等其他國家的水產養殖水域中也都檢測到抗生素抗性基因。以上研究表明，全球地表水體中含有數目“可觀”的抗生素抗性基因，其中四環素類抗性基因和磺胺類抗性基因尤其居多，這可能和相應抗生素的大量使用及其在環境中的殘留有關。雖然環境中本來就存在抗生素抗性細菌，但是環境中抗性基因的急劇增加主要是由于人類大量使用抗生素而對環境造成了巨大的選擇壓力。總之，地表水體已經成為了環境中抗生素抗性基因的一個主要基因庫。

1.2地下水中的抗性基因污染由于動物養殖場污水池及土壤中的抗性基因隨著土壤的滲透作用使得地下水中也開始檢測出抗性基因的存在。Koike等從2000—2003年連續3年分別在兩個養豬場的周圍打井檢測其地下水中的四環素類抗性基因，發現地下水中含有7種四環素類抗性基因。通過對養殖場污水池和地下水中發現的抗性基因序列的比較分析，發現兩者幾乎一致，這說明地下水受到了養豬場污水池的影響，其抗性基因主要來自于污水池。近年來，地下水也已經成為了抗性基因的眾多基因庫之一。

2抗生素抗性基因在環境中的傳播與潛在風險

從上述不同抗性基因的基因庫來看，不難發現各個基因庫之間各有聯系，人類、動物與生態環境之間形成了一個循環(圖1)，使得抗生素抗性基因在其中不斷循環、積累。人類在廣泛使用大量抗生素治療疾病時，由于抗生素的選擇性壓力，使其在人的腸胃及尿道中誘導出含有抗性基因的細菌。此外，腸胃細菌之間、腸胃細菌與經過腸胃的細菌之間，抗性基因都能夠進行水平轉移，又進一步增加了人體內抗性基因的含量。相似的，為了提高家禽養殖業、牛羊畜牧業以及水產養殖業的出產率，人們在飼料中大肆加入抗生素，這在各種動物體內同樣會誘導出相應的抗生素抗性基因。體內含有抗性基因的動物被加工成肉類食品或者奶制品后，其中的抗性基因通過食物鏈又可進入人類體內。研究發現，一些養殖場內的空氣中也含有抗性基因或抗性細菌，當養殖場工作人員吸入養殖場內的空氣時，抗性基因或抗性細菌就會隨空氣一起進入人體。此外，如果人與動物直接接觸，動物體內的抗性基因或抗性細菌也能直接進入人體。隨后，人與動物體內的抗性細菌與抗性基因隨著排泄物一起進入自然環境中。一部分排泄物進入污水處理廠(同時進入污水處理廠的還有醫療廢水)，污水處理廠是抗性基因傳播的重要中轉地，污水處理廠中的處理工藝只能去除一部分抗性細菌與抗性基因，但是大部分抗性細菌和抗性基因不能被去除，甚至某些污水廠出水中抗性基因含量高于污水廠進水，這些抗性基因都隨污水廠出水排入自然水體中，增加了污水處理廠下游水體的抗性基因含量。另一部分排泄物被用作肥料進入土壤生態系統，使排泄物中抗性基因轉移到土壤菌株之中。而污水廠出水部分回用灌溉農田以及污泥堆積施肥更增加了土壤生態系統中的抗性細菌與抗性基因的含量，土壤中的抗性基因能夠水平轉移到莊稼等農作物中，這些農作物被加工成為農產品后又通過食物鏈進入人類體內。由于降雨等原因產生的地表徑流會使土壤中的抗性細菌和抗性基因進入到地表水體中，而土壤系統的滲透作用使得地下水中也含有數量“可觀”的抗性基因。如果這些地表水體或者地下水體被用來作為飲用水水源，雖然給水處理工藝能滅活部分抗性細菌和抗性基因，但仍有大部分抗性基因會隨飲用水進入人類體內。從抗性基因在環境中的循環傳播過程不難看出，抗性基因會在人體內積少成多，增強了人體細胞的耐藥性，對人體健康和生態安全構成巨大威脅。在美國，由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌引起的感染病每年的致死人數比艾滋病、帕金森癥以及殺人犯的總和還要多。當致病菌獲得多重抗性基因后，就既具有致病性又具有多重耐藥性，對人體具有極大的危害。最典型的就是含有NDM-1基因的超級細菌，曾引起世界范圍內的恐慌。所以，加緊研究去除環境中的抗生素抗性基因的處理方法成為當務之急。

3抗生素抗性基因的去除技術

雖然國內外關于抗生素抗性基因在環境中的來源與傳播途徑的研究很多，但是關于抗性基因的去除技術的研究卻很少。近年來，隨著抗性基因污染情況越來越嚴重，一些研究學者們也在探索污水與給水處理廠中不同處理工藝對抗生素抗性基因的去除效果，以期能以最佳的工藝組合方式去除最多的抗性基因。

3.1厭氧/好氧污泥消化處理工藝污水處理廠是抗生素抗性基因最主要的一個儲庫，所以污水處理廠的處理工藝將是去除抗生素抗性基因的關鍵所在。事實上，盡管污水處理廠出水中仍含有抗性細菌和抗生素抗性基因，但絕大多數(>99%)的抗性細菌及抗生素抗性基因存在于污泥沉積物中。近幾年，研究發現污水處理廠中的污泥消化工藝對于降低污泥中抗生素抗性基因的含量有著良好的效果。Ghosh等研究了高溫(50~60℃)和中溫(35~37℃)兩相厭氧消化系統對四環素類抗性基因的去除效果，發現高溫厭氧系統對tetA、tetO、tetX有很好的去除效果，其中tetX的去除率分別達到了85%~99%，而tetA和tetO的去除率也有50%~80%;而在中溫厭氧消化階段對抗性基因的去除效果并不明顯，tetA含量甚至出現了反彈。這一結果顯示抗性基因的去除效果可能與操作溫度有關。隨后，Diehl等研究了不同溫度(22、37、46、55℃)下厭氧或好氧消化對污泥中抗生素抗性基因的去除效果。在厭氧條件下，37、46、55℃下抗性基因顯著減少，并且去除率隨溫度的上升而增大；而在好氧情況下(平均水力停留時間為4d)四環素類抗性基因的含量并沒有明顯降低。Ma等進一步比較了高溫和中溫厭氧系統對抗性基因的去除效果，結果顯示高溫厭氧系統在去除ermB、ermF、tetO、tetW等4種抗性基因的效果確實優于中溫厭氧系統，但是對于其他抗性基因的去除效果，高溫厭氧系統并沒有明顯優勢。Miller等也發現高溫和中溫厭氧消化系統都能降低sul1、sul2抗性基因和int1整合子的含量1到2個數量級，只是中溫厭氧消化系統對tetO和tetW去除效果不理想。Ma等認為高溫消化反應器之所以能夠更有效地去除抗生素抗性基因，一方面是因為更高的溫度有利于促進生化反應的進行，另一方面是因為高溫消化系統中菌群組成結構與中溫消化系統有所不同，而后者起決定作用。此外，污泥齡也影響抗性基因的去除效果，比較兩種不同污泥齡的中溫消化系統，污泥齡為20d的消化系統對抗性基因的去除效果明顯好于污泥齡為10d的消化系統，這一結果與Xia等的結論相一致。雖然Diehl等在試驗中認為好氧消化不能顯著去除抗生素抗性基因，但Burch等認為Diehl等的試驗設計不完整，因為試驗中4d的平均水力停留時間過短，如果抗性基因的半衰期大于4d，即使好氧消化系統能有效去除抗生素抗性基因也無法檢測。因此，Burch等設計試驗的水力停留時間為40d，結果顯示在半連續流條件下對ermB、sul1、tetA、tetW的去除率達到了85%~98%，但是int1含量卻沒有顯著變化，而tetX含量增加了5倍，這可能是由于好氧消化系統對含有int1和tetX的細菌細胞具有選擇性。因此，污水處理廠中的污泥消化工藝在降低抗生素抗性基因含量方面具有潛在的前景，耗氧量、溫度、污泥齡及水力停留時間等都是影響其去除效果的重要因素，而怎樣調整這些影響因素以達到最佳的去除效果在未來值得進行深入的研究。

3.2人工濕地處理工藝人工濕地是一種新型的污水處理設施，一般位于生物處理或者化學處理設備之后，用作二級或者三級處理，由于其工藝簡單、經濟、高效，適用于人口較少的小規模處理，現已被廣泛應用于處理城鎮污水。大量研究已經證明，人工濕地對污水中的有機物、細菌、抗生素、藥物及個人護理品(PPCPs)均有較好的去除效果。但目前關于人工濕地對抗生素抗性基因的去除效果的研究還較少。Chen等調查了杭州及周邊農村地區的污水處理廠，發現應用人工濕地能有效改善對抗性基因的去除效果，在多重厭氧生物過濾處理后添加一道人工濕地處理工藝能去除2個數量級左右的抗性基因，而僅應用多重厭氧生物過濾對抗性基因去除效果很小，這說明人工濕地在去除抗性基因方面具有重要作用。隨后，Chen等比較了污水處理廠中生物曝氣濾池、紫外消毒及人工濕地3種處理方式對抗性基因的去除效果，發現人工濕地的去除效果最好，能降低1到3個數量級的抗性基因，生物曝氣濾池只能降低0.6到1.2個數量級的抗性基因，而紫外消毒后抗性基因基本沒有變化。但是，Anderson等在對加拿大馬尼托巴省某人工濕地調查后發現，出水中只有blaSHV抗性基因的含量有較大幅度的降低，而其他抗性基因含量幾乎沒有明顯降低，這可能是由于人工濕地去除含有blaSHV基因的細菌較多，造成了對blaSHV基因的選擇性去除。Nõlvak等也通過研究發現，水平潛流人工濕地對sul1抗性基因的去除效果尤為突出，而對其他抗性基因的去除效果與常規處理效果差不多。Liu等在研究火山巖濾料垂直流人工濕地和沸石濾料垂直流人工濕地對養豬場廢水的處理效果時發現，火山巖濾料人工濕地對抗性基因含量的去除率為50%，而沸石濾料人工濕地能降低抗性基因含量一個數量級。這可能與兩種濾料的孔徑大小有關，沸石濾料的平均粒徑(4.32nm)比火山巖濾料的平均粒徑(10.78nm)小，更小的粒徑有利于抗性基因的去除。Yang等在研究不同類型人工濕地對抗性大腸桿菌及抗性基因的去除時發現，抗性基因的檢測率從大到小依次為：基質≥出水>進水。其中，sul抗性基因在進水、出水及基質生物膜中的檢測率分別為50%、61%和81%；tet抗性基因在進水、出水及基質生物膜中的檢測率分別為67%、77%和76%。這可能是因為抗性基因能遷移到基質生物膜上，從而增加了膜上的抗性基因含量，而生物膜中的抗性基因遷移到水中又增加了出水中的抗性基因含量。但是，上述兩位學者都認為人工濕地的處理效果與濕地中植物覆蓋率、植物種類、水力負荷以及當地氣候都有著緊密的聯系，不同人工濕地對抗性基因的去除效果也不一樣。以上研究說明人工濕地對去除抗性基因可能具有某種選擇性。因此，對于人工濕地的實際應用，應針對不同的抗性基因采用不同的填料或不同類型的人工濕地，做到“對癥下藥”。

3.3消毒處理工藝不論在給水還是污水處理工藝中，消毒工藝都是非常重要的一步。現有的消毒工藝主要有自由性氯消毒(加氯消毒)、氯胺消毒、臭氧消毒及紫外輻射消毒。在眾多消毒工藝中，應用最廣泛的是加氯消毒和紫外消毒。雖然消毒工藝能有效滅活水中的細菌微生物，但是關于消毒工藝能否有效地去除水體中的抗生素抗性基因的研究還較少。

3.3.1加氯消毒工藝加氯消毒的機理如圖2所示，氯氣作為一種氧化劑，能氧化細菌細胞，改變細胞膜的滲透性，從而進入細胞內破壞細胞質，最終分解RNA和DNA。而游離性有效氯對胞外被膜中的大部分物質的反應活性為中等水平，只是對脂類和糖類反應活性很低。所以，一般氯會在細胞壁與細胞膜中消耗一部分，剩余部分進入細胞質，并氧化胞內DNA，使其失活。最早，Venkobachar等發現用氯氧化大腸桿菌時，當加氯量為1.5mg•L-1時，能在上清液中檢測出蛋白質和RNA；當添加量增加時，能在上清液中檢測出DNA。Suquet等發現在50mmol•L-1、pH為7.4的磷酸緩沖溶液中，當加氯消毒CT值大于180mg•L-1•min-1時，溶液中出現大量DNA碎片。由此可見，在游離性有效氯消毒過程中，只有當加氯量較高時才能破壞分解大量DNA。在實際應用中，經加氯消毒處理后，Munir等發現抗性基因的含量并沒有顯著減少，Gao等也發現污水處理廠中加氯消毒并不能有效減少tet和sul類抗性基因的含量。此外，還有研究發現，較高劑量的加氯消毒能增加四環素類抗性細菌的抗藥性，因為高劑量的氯消毒對抗性細菌產生了“篩選”作用。

3.3.2紫外消毒工藝與加氯消毒不同，紫外輻射消毒是個物理過程，通過光化學反應滅活細胞。從細胞內物質對其反應活性看，只有嘌呤和嘧啶核苷基、核苷酸吸收253.7nm波長的紫外光，所以，紫外光的專一性使其具有潛在的有效滅活抗性基因的可能。早先，Munakata等就發現紫外輻射能夠破壞雙鏈DNA中抗性基因的轉換能力，從而降低了抗性基因的水平轉移風險。Guo等研究結果顯示，在污水處理廠的污水中，紅霉素類抗性基因和四環素類抗性基因的含量分別為(3.6±0.2)×105和(2.5±0.1)×105copies•L-1，經5mJ•cm-2劑量的紫外消毒后，紅霉素類和四環素類抗性基因含量分別降低了(3.0±0.1)和(1.9±0.1)個數量級；此外，還發現經紫外消毒后兩類抗生素抗性菌的數量出現顯著降低，然而四環素類抗性細菌占細菌總數的比例卻有所增加，由此說明紫外消毒對四環素類抗性基因具有一定的選擇作用。McKinney等用紫外消毒處理4種抗性基因(mecA、vanA、tetA、ampC)后發現紫外輻射確實能夠降低抗性基因的含量，但滅活抗性基因3到4個數量級所需的紫外劑量為200~400mJ•cm-2，遠遠大于滅活抗性細菌所需要的紫外劑量(滅活4到5個數量級的抗性細菌，需要紫外劑量為10~20mJ•cm-2)。VanAken等也在試驗中發現，使用紫外輻射處理大腸桿菌細胞懸浮液，DNA含量降低2個數量級所需要的紫外劑量為23mJ•cm-2，遠大于滅活大腸桿菌細胞所需的劑量(8.7mJ•cm-2)。綜上所述，紫外消毒工藝能有效降低抗生素抗性基因的含量，但是所需的紫外劑量較高，遠超過實際應用的劑量。在實際應用中，Auerbach等發現紫外消毒對減少污水中四環素類抗性基因的種類以及降低tetQ、tetG的含量都沒有明顯的效果。因此，尋求更有效的方法是當務之急。近年來，有研究發現添加TiO2納米顆粒與近紫外光復合使用能提高其去除抗性基因的效率，使得紫外消毒處理抗性基因與處理抗性細菌所需消毒劑量相當，Li等也發現加入Ag-TiO2復合納米材料能大大提升紫外光消毒的效果。這給未來研究有效去除抗性基因的消毒工藝提供了方向。

3.4深度處理工藝隨著飲用水工藝的不斷發展，以及人們對飲用水要求的不斷提高，現今污水/給水處理廠中除了常規處理工藝之外，還應用了許多水深度處理工藝。目前，研究較多的水深度處理工藝主要有膜處理、高級氧化等。Öncü等發現，用TiO2光催化氧化和臭氧氧化處理12.8和6.4μg•mL-1兩種濃度的質粒DNA均有顯著的效果，其可以破壞DNA的超螺旋結構，從而滅活DNA。試驗中發現質粒DNA的濃度隨臭氧氧化劑量的增加而減少，對于高濃度質粒DNA溶液，當臭氧劑量為4.2mg•L-1時質粒DNA濃度最低；對于低濃度質粒DNA溶液，當臭氧劑量為0.9mg•L-1時超螺旋DNA雙鏈已完全消失。TiO2光催化氧化效果與臭氧氧化效果類似，高濃度質粒DNA溶液在經過75min的TiO2光催化降解后，超螺旋DNA雙鏈全部消失；而對于低濃度的質粒DNA溶液，TiO2光催化降解只需15min就可以將其中的所有超螺旋DNA雙鏈破壞掉。Cengiz等應用芬頓試劑高級氧化工藝和臭氧氧化工藝去除養牛場廢水中的tetM抗性基因，發現兩種工藝中抗性基因的變化趨勢一致，即抗性基因的含量隨著氧化劑劑量的增加而減小，當芬頓試劑添加量達到40mmol•L-1H2O2/4mmol•L-1Fe2+時去除效果最好。除了高級氧化工藝之外，膜處理工藝對抗生素抗性基因也有很好的效果。Munir等比較了活性污泥法+氯消毒、氧化溝+紫外消毒、旋轉生物接觸氧化+氯消毒、膜生物反應器+紫外和活性污泥+紫外這5種不同處理工藝對抗性基因的去除效果，發現膜生物反應器對抗性基因的去除效果最好，能降低抗性基因的含量2.57~7.06個數量級。Breazeal等研究了膜孔徑從0.45μm到1000道爾頓的微濾/超濾膜對抗性基因的去除效果，發現微濾膜對抗性基因的去除效果不大，但是膜孔徑為10萬、1萬、1千道爾頓的超濾膜分別能使抗生素抗性基因含量降低1.7、4.9、>5.9個數量級；試驗還發現水中的膠體物質對超濾膜去除抗性基因有促進作用，并且膜孔徑越小，這種促進作用越明顯。總之，隨著深度處理工藝應用的越發成熟，其在未來去除抗生素抗性基因的處理工藝中必定會占據一席之地。

4研究展望

目前，國內關于去除抗生素抗性基因方法的研究仍然很少，針對抗生素抗性基因的研究仍有很多問題亟待解決，主要包括：1)繼續深入調查研究不同種類抗性基因在我國各個區域環境中的分布以及具體來源，并且定量分析各個區域的抗性基因污染水平。2)許多抗生素抗性基因常與一些可移動遺傳元件相關聯，而這些元件往往還攜帶大量其他種類的抗性基因，這使微生物具有多重抗性。因此需盡快開展對環境中多重抗性的污染水平、多重抗性基因種類及基因水平遷移規律的研究，評估其生態健康風險，為控制抗性基因污染提供理論依據。3)污水/給水處理廠是抗性基因的主要儲庫，也是去除抗性基因的關鍵。不同水處理工藝及其組合工藝對于抗性基因的去除效果，以及不同組合工藝在不同工況條件下抗生素抗性基因的遷移轉化規律及去除機制亟待研究。

作者：文漢卿史俊尋昊鄧慧萍單位：同濟大學環境科學與工程學院