棉花后代群體篩選方式分析范文

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轉基因植株的篩選鑒定是植物轉基因研究的重要環節。目前，轉基因棉花篩選鑒定的常用方法為卡那霉素篩選法和PCR分子檢測法［1－2］。針對不同試驗目的，這兩種方法相關報道的文獻較多，但都有較強的針對性，在實際轉基因棉花育種過程中，這兩種方法的應用均存在弊端?？敲顾睾Y選法不能反映目的基因的表達效果，其篩選結果缺乏可靠性。PCR分子檢測法對試驗室要求嚴格，檢測費用昂貴，檢測周期長。此外，轉基因克隆研究的發展迅速，不斷出現新的抗蟲基因、抗旱基因、抗病基因［3］，通過外源目的基因表達，而進行生物測定的篩選方法各不相同，過程復雜，篩選緩慢。特別是近年，隨著大規模轉基因研究的相繼開展，傳統的篩選方法已無法滿足大規模轉基因后代的高效篩選，尤其是在轉基因雜交育種中，需要在開花前得到準確篩選結果，以便育種操作，傳統的篩選方法在效率上尚略顯不足。因此，探索一種快速，準確、較為系統的篩選方法，進行大規模轉基因棉花后代群體的篩選顯得尤為重要。本試驗結合我國棉花轉基因育種中的兩個主流方法［4－5］，以花粉管導入［6］外源基因自交系T1－T3、轉基因雜交育種F1種子為材料，探討田間卡那霉素篩選與PCR分子鑒定相結合，應對大規模轉基因棉花后代篩選的可靠性和實用性，為轉基因棉花后代的篩選鑒定提供參考。

1材料與方法

1．1材料供試品種為綠色棉隴綠棉3號、白色棉隴棉2號、棕色棉BC05，均由甘肅省農科院作物所棉花研究室選育、提供，具有纖維品質優良、產量穩定等突出性狀［7－8］。轉基因鑒定的供試材料為：①通過花粉管通道法對隴綠棉3號、BC05導入抗蟲基因GNA、抗旱基因GhABF2的T1－T3；②WBK09、20090713－1979分別與隴綠棉3號、BC05、隴棉2號雜交F1（GNA、GhABF2的基因質粒、引物序列由中國農科院生物技術研究所提供；WBK09含Bt抗蟲基因，材料和引物序列均由中國農科院生物技術研究所提供；20090713－1979含BADH抗旱基因，材料和引物序列由新疆農業大學農學院提供），花粉管導入T1－T3材料為海南、敦煌兩地繁育所得，WBK09、20090713－1979與供試品種雜交F1由海南育種所得。GNA、GhABF2的基因質粒與WBK09、20090713－1979均攜帶NPTⅡ標記基因（新霉素磷酸轉移酶基因），該基因是目前基因工程中被廣泛使用的選擇標記，它對植物細胞表現毒性的機理是：卡那霉素干擾了細胞葉綠體及線粒體的蛋白質合成，最終導致植物細胞死亡，而轉基因植株抑制了這個過程［9－10］。供試材料種植于甘肅省敦煌市肅州鎮隔離試驗區。分子鑒定地點為甘肅省農科院生物技術研究所基因工程研究室。

1．2方法

1．2．1卡那霉素濃度梯度試驗。設置卡那霉素3．0g•L－1、5．0g•L－1、7．0g•L－1三個處理濃度，在棉花現蕾期，對供試品種頂端倒數第2片真葉用毛筆涂抹藥液，各處理50株，以WBK09做對照（經過PCR分子檢測，攜帶NPTⅡ標記基因），3～5d觀察統計結果。

1．2．2卡那霉素抗性植株篩選。在卡那霉素濃度梯度試驗的基礎上，對轉基因供試材料進行卡那霉素篩選，對篩選后的陽性植株做標記，以備PCR分子檢測。

1．2．3PCR分子檢測。剪取陽性植株頂端較嫩葉片，采用改良的CTAB大量提取法［11］提取純化基因組DNA，針對陽性植株所含不同基因，利用設計好的引物（表1）進行PCR檢測。PCR體系所用藥劑為Fermentas公司生產，采用引物由Invitrogen公司合成，統計檢測結果。

2結果與分析

2．1不同品種敏感性及卡那霉素篩選條件的確定根據田間觀察結果，對棉葉與卡那霉素處理反應的表現分為三個等級，Ⅰ級：涂抹葉片正常；Ⅱ級：涂抹葉片有輕微變黃；Ⅲ級：涂抹葉片具有黃色斑點（圖1），為了得到可靠的卡那霉素篩選結果，消除棉花葉片自身對卡那霉素具有抗性的試驗影響，以Ⅲ級處理結果作為卡那霉素篩選標準。在該篩選標準下，對試驗結果進行統計，結果表明：三種濃度的卡那霉素棉葉涂抹，3～5d內，均使隴棉2號、隴綠棉3號、BC05的棉葉百分之百轉變為具有黃色斑點的葉片；對照WBK09經過濃度為7．0g•L－1卡那霉素棉葉涂抹，在3～5d內，葉片仍未變化。該結果表明，3．0～7．0g•L－1卡那霉素葉片涂抹，可以明顯區分轉基因與非轉基因植株。此外，參試品種在5．0g•L－1卡那霉素葉片涂抹處理下，百分之百轉變為具有黃色斑點葉片，隴棉2號需要3d，BC05需要4d，而隴綠棉3號需要5d；因此，可以認為，隴棉2號棉葉對卡那霉素最為敏感，BC05次之，隴綠棉3號棉葉與卡那霉素反應最為遲緩。在保證準確性的前提下，為了快速得到篩選結果，可以確定隴棉2號的最佳篩選條件為5．0g•L－1卡那霉素葉片涂抹，0～3d觀察期；BC05的最佳篩選條件為5．0g•L－1卡那霉素葉片涂抹，0～4d觀察期；隴綠棉3號的最佳篩選條件為3．0g•L－1卡那霉素葉片涂抹，0～5d觀察期（見表2）。

2．2卡那霉素篩選結果分析在確定卡那霉素篩選最佳條件后，以各品種最佳篩選條件對相關轉基因后代進行田間篩選操作，0～5d內，共計篩選出820份葉片未變色的植株，其中，隴棉2號181株，隴綠棉3號324株，BC05315株。隴棉2號、隴綠棉3號、BC05在篩選過程中得到穩定篩選結果的時間分別為第3d，第4d，第5d（表3），該結果表明，針對不同品種確定的最佳篩選條件具有一定的可靠性。由于操作簡單，本次試驗僅用5d完成21112份轉基因棉花后代材料的田間篩選，因此，可以認為，田間卡那霉素篩選可以快速、準確地篩選出具有卡那霉素抗性的轉基因植株。

2．3PCR分子檢測結果分析對820份陽性植株，進一步進行PCR分子檢測，得到具備NPTⅡ標記基因的材料806份，攜帶目的基因的材料有161份，其中轉基因雜交育種F1中，有158份含有目的基因；通過花粉管導入基因的T1－T3材料中，雖然有269份材料驗證出NPTⅡ標記基因，但只有3份材料具備目的基因（表4，圖2）；經過多次重復，結果一致。該結果表明：卡那霉素陽性植株篩選的準確率為98．3％，卡那霉素篩選攜帶目的基因的轉基因植株準確率為20％；處于連鎖狀態的標記基因與目的基因，在轉基因育種過程中沒有完全轉化或遺傳。

3結論與討論

本試驗通過對隴棉2號、隴綠棉3號、BC05非轉基因植株進行卡那霉素敏感試驗，以確定田間卡那霉素篩選的最佳條件，在此試驗基礎上，對其相關轉基因后代進行田間卡那霉素初篩，對篩選后的材料進行分子鑒定。試驗結果表明，在實際轉基因棉花育種中，應對大規模轉基因棉花后代篩選鑒定，卡那霉素葉片涂抹與目的基因PCR檢測相結合，具有簡單、快速、準確的特點，是一種高效的篩選方法，具備一定的實用性。在卡那霉素濃度梯度試驗中，不同品種的棉葉對卡那霉素的敏感性不同，與白色棉隴棉2號相比，綠色棉隴綠棉3號，棕色棉BC05的葉片小，蠟質層較厚，該生理性狀影響葉片與卡那霉素反應。王彥霞、燕麗萍、李舉等［12－14］在卡那霉素篩選研究中，使用的卡那霉素篩選濃度也各不相同。因此，不同品種在不同地區做轉基因材料田間篩選，要得到準確的篩選結果，必須進行前期梯度試驗。在PCR分子檢測試驗中，標記基因鑒定結果與目的基因鑒定結果相差甚遠，這種情況在通過花粉管導入后代的材料中尤其明顯，祝建波［15］在研究過程中也發現類似情況，并推測原因是：在轉基因過程中，標記基因與目的基因在核酸酶的影響下，形成不完整片段。由于這種原因一般只導致出現個別異常，在本次試驗中，試驗群體龐大，不會造成差異如此懸殊的標記基因與目的基因鑒定結果，所以，在本次試驗的基礎上，推測原因為：處于連鎖狀態的標記基因和目的基因在轉基因過程中存在分離情況。該推測需要進一步試驗研究進行論證，但試驗結果可以明確，卡那霉素篩選準確率低，目的基因PCR鑒定才是準確的篩選方法。在大規模轉基因棉花育種中，快速、準確的篩選尤為重要。尤其在轉基因雜交育種過程中，需要在開花前得到準確的篩選結果，以便進行親本選配及雜交組合的田間操作，此時，如果對轉基因育種T0進行卡那霉素快速篩選，縮小范圍后，再進行準確的分子鑒定跟蹤，可以大規模減少后代群體，提高篩選效率，盡早篩選得到含有目的基因的轉基因材料，加快其后代進行遺傳穩定性、基因表達量的研究，縮短安全性申報及產業化進程。