納米管觸致工人氧化損傷炎癥反應(yīng)研究范文

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摘要：[目的]研究多壁碳納米管（MWCNTs）職業(yè)接觸對(duì)工人氧化損傷及炎癥反應(yīng)水平的影響，制定職業(yè)危害預(yù)防策略。[方法]分別選取廣東省某MWCNTs生產(chǎn)企業(yè)不吸煙的長(zhǎng)期接觸MWCNTs的工人和不接觸職業(yè)病危害因素的行政管理人員各40人作為接觸組和對(duì)照組。對(duì)工作場(chǎng)所中MWCNTs濃度進(jìn)行檢測(cè)。采集研究對(duì)象血樣，檢測(cè)氧化損傷和炎癥反應(yīng)指標(biāo)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。[結(jié)果]接觸組在工作場(chǎng)所及個(gè)體接觸的MWCNTs濃度分別為（41.5±18.7）μg/m3和（34.4±17.7）μg/m3，均明顯高于美國(guó)國(guó)家職業(yè)安全衛(wèi)生研究所（NIOSH）推薦的容許接觸限值（7μg/m3）。接觸組8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）、8-異前列腺素F2α（8-iso-PGF2α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素8（IL-8）、白細(xì)胞介素33（IL-33）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、骨橋蛋白（OPN）、嗜酸性粒細(xì)胞水平高于對(duì)照組，接觸組過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平低于對(duì)照組，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或0.05）；兩組其他抗氧化指標(biāo)、炎癥反應(yīng)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。[結(jié)論]高濃度的MWCNTs職業(yè)接觸可導(dǎo)致工人體內(nèi)活性氧水平增高，引發(fā)機(jī)體氧化損傷甚至是細(xì)胞脂膜DNA損傷，并可導(dǎo)致部分炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子和嗜酸性粒細(xì)胞水平升高，加重呼吸道炎癥反應(yīng)和哮喘癥狀，對(duì)肺功能造成損害。接觸MWCNTs的勞動(dòng)者應(yīng)注意加強(qiáng)個(gè)人防護(hù)。

關(guān)鍵詞：多壁碳納米管；職業(yè)接觸；氧化損傷；炎癥反應(yīng)；肺功能；呼吸道炎癥

碳納米管（carbonnanotube）是繼碳60（C60）之后發(fā)現(xiàn)的碳的又一同素異形體，是由單層（單壁碳納米管，single-walledcarbonnanotubes，SWCNTs）或多層（多壁碳納米管，multi-walledcarbonnanotubes，MWCNTs）碳原子呈六邊形排列而構(gòu)成的同軸圓管。作為復(fù)合材料增強(qiáng)體，MWCNTs強(qiáng)度高、彈性好，表現(xiàn)出良好的抗疲勞性及各向同性，因而在超級(jí)電容器、催化器載體、儲(chǔ)氫材料、質(zhì)子交換膜燃料電池等產(chǎn)品的生產(chǎn)中被廣泛使用，是目前全球新材料研究的一個(gè)熱點(diǎn)[1-2]。但有研究表明：MWCNTs顆粒能引起染毒小鼠肺部炎癥、肉芽腫、纖維化[3]；另外，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL-1β、IL-6、IL-8）等細(xì)胞因子均可參與其引起的炎癥反應(yīng)[4]。MWCNTs可誘導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS），引起機(jī)體氧化應(yīng)激[5-7]。然而，上述研究均在體外細(xì)胞模型或動(dòng)物模型中開展，MWCNTs對(duì)職業(yè)接觸人群能否造成氧化損傷及炎癥反應(yīng)，仍須通過職業(yè)流行病學(xué)研究來驗(yàn)證。為此，作者進(jìn)行了本項(xiàng)研究。

1對(duì)象與方法

1.1對(duì)象

研究對(duì)象來自廣東省某從事碳納米管開發(fā)和生產(chǎn)的高科技企業(yè)，該企業(yè)擁有約200名員工。粉碎、干燥、反應(yīng)3個(gè)工種的92名工人存在職業(yè)性MWCNTs接觸，其中反應(yīng)工種的工人為工作時(shí)間8h完全接觸，其他2個(gè)工種為間歇性接觸。從中選擇40名長(zhǎng)期接觸MWCNTs（接觸時(shí)間不低于2年）的反應(yīng)工種工人作為接觸組，選擇該企業(yè)不接觸職業(yè)病危害因素的40名行政管理人員作為對(duì)照組，入選對(duì)象均無吸煙習(xí)慣。接觸組男性21名，女性19名，平均年齡（32.6±6.5）歲，接觸MWCNTs平均工齡（4.1±3.0）年；對(duì)照組男性18名，女性22名，平均年齡（33.1±7.1）歲。兩組年齡和性別構(gòu)成差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t年齡=1.168，χ2性別=0.450，P＞0.05）。

1.2方法

1.2.1主要儀器與試劑采用的主要儀器：酶標(biāo)儀（美國(guó)ThermoScientificMultiskan公司）、血細(xì)胞全自動(dòng)分析儀（美國(guó)BeckmanCoulter公司）、紫外可見分光光度計(jì)（日本Unico公司）、化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（德國(guó)RocheDiagnostics公司）；采用的主要試劑：超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化酶（glutathioneperoxidase，GSH-Px）、丙二醛（malonicdialdehyde，MDA）、8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2'-deoxyguanosine，8-OHdG）、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-33、TNF-α及骨橋蛋白（osteopontin，OPN）檢測(cè)試劑盒購于南京建成生物工程研究所，人8異前列腺素F2α（8-epi-prostaglandinF2alpha，8-iso-PGF2α）檢測(cè)試劑盒購于上海斯信生物科技有限公司，趨化因子C-C-基元配體2（CCL2）檢測(cè)試劑盒購于上海語純生物科技有限公司。

1.2.2檢測(cè)方法（1）工作場(chǎng)所MWCNTs接觸水平檢測(cè)：工作場(chǎng)所MWCNTs接觸的定點(diǎn)空氣采樣和個(gè)體接觸采樣的具體采樣步驟和分析方法按照NIOSHMethod5040[8]進(jìn)行。（2）生物樣本采集和處理：采集所有研究對(duì)象肘靜脈血5mL至EDTA-2K抗凝血管，5mL至促凝血管。采血后4h之內(nèi)分別分離出血細(xì)胞和血清，0.5mL分裝并編號(hào)后，置-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩＃?）檢測(cè)指標(biāo)與方法：血清SOD、CAT、GSH-Px、MDA采用比色法測(cè)定，血清IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-33、TNF-α、CCL2采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，血清8-OHdG、8-iso-PGF2α、OPN采用ELISA測(cè)定，白細(xì)胞及其分類計(jì)數(shù)采用血細(xì)胞全自動(dòng)分析儀檢測(cè)。1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，理論頻數(shù)不符合χ2檢驗(yàn)要求的采用Fisher確切概率法進(jìn)行檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1工作場(chǎng)所碳納米管暴露水平檢測(cè)及防護(hù)情況

該公司生產(chǎn)的MWCNTs外直徑約80nm。在企業(yè)的反應(yīng)車間，對(duì)10個(gè)采樣點(diǎn)的MWCNTs在空氣中的時(shí)間加權(quán)平均濃度（指質(zhì)量濃度）進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得最小值為33.1μg/m3，最大值56.2μg/m3，均值（41.5±18.7）μg/m3；對(duì)10名隨機(jī)選取的工人的個(gè)體接觸濃度（時(shí)間加權(quán)平均濃度）進(jìn)行采樣檢測(cè)，最小值29.6μg/m3，最大值51.8μg/m3，均值（34.4±17.7）μg/m3。工作場(chǎng)所及個(gè)體接觸的MWCNTs濃度均明顯高于美國(guó)國(guó)家職業(yè)安全衛(wèi)生研究所（NIOSH）根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果推薦的容許接觸限值（7μg/m3）。作業(yè)場(chǎng)所防護(hù)通風(fēng)排毒設(shè)施運(yùn)行正常，所有工人都按要求穿戴防護(hù)用品（防護(hù)口罩、乳膠手套、防護(hù)服）。該公司配發(fā)的防護(hù)口罩符合美國(guó)材料與試驗(yàn)協(xié)會(huì)（ASTM）的LevelⅢ標(biāo)準(zhǔn)的要求：對(duì)小至100nm顆粒物的過濾效率應(yīng)達(dá)到98%以上。工人平均每天工作8h，每月工作26d。

2.2氧化損傷水平檢測(cè)結(jié)果

接觸組的3個(gè)抗氧化指標(biāo)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平均低于對(duì)照組，其中CAT和GSH-Px與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。接觸組的3個(gè)氧化損傷指標(biāo)丙二醛（MDA）、8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）、8-異前列腺素F2α（8-iso-PGF2α）水平均高于對(duì)照組，其中8-OHdG和8-iso-PGF2α與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.3炎癥反應(yīng)水平檢測(cè)結(jié)果

2.3.1血清炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果除CCL2外，接觸組7個(gè)血清炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子濃度均高于對(duì)照組，其中白細(xì)胞介素（IL-6、IL-8、IL-33）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、骨橋蛋白（OPN）濃度與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或0.05）。見表2。

2.3.2白細(xì)胞及其分類計(jì)數(shù)除嗜堿性粒細(xì)胞（BASO）計(jì)數(shù)外，接觸組白細(xì)胞（WBC）總數(shù)及其他4種分類白細(xì)胞，即淋巴細(xì)胞（LYM）、單核細(xì)胞（MONO）、中性粒細(xì)胞（NEU）、嗜酸性粒細(xì)胞（EO）計(jì)數(shù)均高于對(duì)照組，其中EO計(jì)數(shù)與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表3。

3討論

作為一種應(yīng)用越來越廣泛的新型材料，碳納米管的接觸人群必將不斷擴(kuò)大。MWCNTs主要經(jīng)呼吸道進(jìn)入體內(nèi)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MWCNTs進(jìn)入體內(nèi)后主要分布于肺臟，其次是腎臟，在肝臟和脾臟內(nèi)也有少量分布并有蓄積。MWCNTs在體內(nèi)不易降解，主要通過肝腎代謝排出體外[9]。有研究表明，碳納米管主要對(duì)肺部造成損傷，如肺部炎癥、肉芽腫、纖維化等[3]，并增加支氣管纖維化，加重哮喘相關(guān)病癥，如氣道高反應(yīng)性、氣道重塑現(xiàn)象以及肺部炎癥加重[10]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MWCNTs染毒可致肺巨噬細(xì)胞的細(xì)胞核變性、核基質(zhì)減少，染色質(zhì)濃縮，出現(xiàn)月牙樣邊界，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡，這些均為細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)[3]。近年也有碳納米管對(duì)心血管系統(tǒng)損傷的報(bào)道，如主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體DNA發(fā)生劑量-反應(yīng)性氧化損傷、血管內(nèi)血栓形成等[11-12]。然而，這些研究絕大多數(shù)在體外細(xì)胞模型或動(dòng)物模型中開展，缺乏人群健康損害的證據(jù)。作者曾針對(duì)本文涉及的相同研究對(duì)象的職業(yè)健康檢查表明，接觸組哮喘發(fā)病率（20%）明顯高于對(duì)照組（2.50%）；接觸組咳嗽發(fā)生率（22.50%）、咳痰發(fā)病率（25.00%）、喘息發(fā)病率（20.00%）均高于對(duì)照組（分別為5.00%、5.00%、2.50%）；肺功能檢查結(jié)果顯示接觸組用力肺活量為（3.38±0.85）L，第1秒用力呼氣量為（3.13±0.67）L，均低于對(duì)照組[分別為（3.76±0.85）L、（3.49±0.85）L]；以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。具體參見文獻(xiàn)[13]。SOD、CAT、GSH-Px均屬于機(jī)體重要的抗氧化酶，可有效防止活性氧的損傷效應(yīng)。MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，可間接反映氧化損傷程度[14]。8-OHdG是活性自由基攻擊DNA分子，使鳥嘌呤堿基第8位碳原子羥基化而形成的一種產(chǎn)物，該產(chǎn)物水平增高反映氧化應(yīng)激對(duì)DNA的損傷[15]。8-iso-PGF2α是自由基損害脂質(zhì)細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸等脂類后的特異性產(chǎn)物。

它能夠選擇性地收縮腎臟、冠狀動(dòng)脈、視網(wǎng)膜和肺臟等臟器的血管，并且可放大炎癥細(xì)胞及炎癥介質(zhì)的作用[16]。本研究結(jié)果顯示，MWCNTs可誘發(fā)機(jī)體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，可能引起機(jī)體過度氧化應(yīng)激，甚至對(duì)細(xì)胞脂膜DNA造成損傷。多種細(xì)胞因子均可影響炎癥進(jìn)程，IL-6、IL-8、TNF-α的水平升高可有效刺激炎癥發(fā)生，哮喘患者尤為明顯[17]；體外實(shí)驗(yàn)表明IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等細(xì)胞因子均參與碳納米管引起的炎癥反應(yīng)[4]。IL-33及其受體ST2可通過調(diào)解免疫應(yīng)答，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，哮喘病人的血清IL-33表達(dá)升高[18]。有研究認(rèn)為MWCNTs能誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞分泌IL-33，后者通過與肥大細(xì)胞表面ST2受體結(jié)合而導(dǎo)致肺部炎癥、肉芽腫、纖維化[19]。嗜酸性粒細(xì)胞是白細(xì)胞的一種，在變態(tài)反應(yīng)性疾病如支氣管哮喘、蕁麻疹中，患者嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增高。OPN對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞功能具有趨化和調(diào)節(jié)作用，誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞向氣道遷移，促進(jìn)氣道變態(tài)反應(yīng)性炎癥的發(fā)生，參與哮喘發(fā)病[20]。本研究結(jié)果表明，接觸MWCNTs可提高工人體內(nèi)某些炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的水平，造成氣道高反應(yīng)性，引發(fā)以嗜酸性粒細(xì)胞增多及浸潤(rùn)為主的慢性氣道炎癥，加重哮喘癥狀，并出現(xiàn)肺免疫毒性損傷，從而引起工人肺功能降低。體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，MWCNTs通過胞吞和擴(kuò)散等方式進(jìn)入細(xì)胞，刺激細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)（TNF-α、IL-6、IL-8、IL-33等），在細(xì)胞內(nèi)提升活性氧（ROS）水平，降低抗氧化劑含量，導(dǎo)致8-OHdG等氧化產(chǎn)物水平升高，對(duì)多種細(xì)胞系造成氧化損傷和細(xì)胞毒效應(yīng)，引發(fā)呼吸道炎癥和纖維化[21]。本文研究結(jié)果與之一致。值得注意的是，MWCNTs介導(dǎo)的氧化損傷對(duì)炎癥反應(yīng)可能起到協(xié)同效應(yīng)，這種協(xié)同效應(yīng)的產(chǎn)生可能與碳納米管通過直接和間接途徑形成的ROS促進(jìn)NLRP3炎性小體的激活有關(guān)[22]。值得注意的是，雖然本次調(diào)查對(duì)象所處的作業(yè)場(chǎng)所通風(fēng)排毒設(shè)施運(yùn)行正常，所有工人都按要求穿戴防護(hù)用品（防護(hù)口罩、乳膠手套、防護(hù)服），但工人仍受到健康損害。

分析其原因可能有：（1）美國(guó)職業(yè)安全與衛(wèi)生管理局規(guī)定合成石墨的時(shí)間加權(quán)平均容許濃度為5mg/m3，石英為0.1mg/m3，美國(guó)國(guó)家職業(yè)安全衛(wèi)生研究所根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果推薦的碳納米管職業(yè)接觸限值為7μg/m3，說明碳納米管的毒性遠(yuǎn)高于合成石墨、石英。多數(shù)碳納米管生產(chǎn)企業(yè)可能對(duì)MWCNTs的健康損害了解不夠，將MWCNTs歸類為合成石墨，僅采用5mg/m3作為接觸限值，這在一定程度上反映了對(duì)該物質(zhì)的健康危害缺乏重視。（2）雖然該公司配發(fā)的防護(hù)口罩是市面上的頂級(jí)產(chǎn)品，對(duì)小至100nm的顆粒物的過濾效率達(dá)99.8%，但該公司生產(chǎn)的MWCNTs外直徑約80nm，被人體吸入機(jī)會(huì)肯定高于0.2%，故工人長(zhǎng)期低劑量吸入MWCNTs引起的健康損害不容忽視。目前，國(guó)內(nèi)外已有納米粉塵防護(hù)口罩的發(fā)明專利，這類口罩能更有效地阻止納米粉塵的吸入。綜上所述，高濃度的MWCNTs職業(yè)接觸可導(dǎo)致工人體內(nèi)ROS水平增高，引發(fā)機(jī)體氧化損傷甚至是細(xì)胞脂膜DNA損傷，并可導(dǎo)致IL-6、IL-8、IL-33、TNF-α、OPN等炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子和嗜酸性粒細(xì)胞水平升高，加重呼吸道炎癥反應(yīng)和哮喘癥狀，對(duì)肺功能造成損害。接觸MWCNTs的勞動(dòng)者應(yīng)注意加強(qiáng)個(gè)人防護(hù)，以降低相關(guān)健康損害的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，高濃度MWCNTs職業(yè)接觸背后更細(xì)微、更具體的機(jī)制（例如通過哪種途徑介導(dǎo)的ROS水平升高）仍有待進(jìn)一步研究。

作者：周金鵬 張方方 黃紅英 馮文艇 單位：深圳市職業(yè)病防治院