蔬菜中有機(jī)酸與磺胺類抗生素探析范文

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《分析試驗(yàn)室》2016年第10期

摘要:

建立了同時(shí)提取和測定蔬菜中有機(jī)酸與磺胺類抗生素的方法。通過對液相色譜分析條件的優(yōu)化，建立了以PenomenexC18為分析柱，以0.5%(NH4)2HPO4-H3PO4溶液(pH3.0)為流動(dòng)相，柱溫30℃，流速1.0mL/min，紫外檢測器檢測波長為210nm和270nm的檢測方法。并比較了水提取，0.1%H3PO4，0.5%(NH4)HPO4，0.5%KH2PO44種不同溶液對有機(jī)酸和磺胺的提取效果。結(jié)果表明:4種提取方法下，乙酸、檸檬酸提取率無顯著性差異，草酸、蘋果酸、富馬酸、磺胺(SA)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)均以水提的效果較好。7種有機(jī)酸和2種磺胺類抗生素線性關(guān)系良好，檢出限為0.21～1.95ng/g，樣品的加標(biāo)回收率81.2%～96.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于8.6%，方法適用于蔬菜中有機(jī)酸和磺胺類抗生素快速、高效的分離。

關(guān)鍵詞:

高效液相色譜;蔬菜;有機(jī)酸;磺胺類抗生素

有機(jī)酸廣泛存在于植物體內(nèi)、根際區(qū)域和土壤環(huán)境中。一方面，有機(jī)酸作為水果、蔬菜中的特有成分，它的種類和含量不單決定著果蔬的風(fēng)味以及品質(zhì)的好壞，也是果蔬加工貯藏的重要依據(jù)。另一方面，當(dāng)植物處于不良環(huán)境中時(shí)，植物根系會(huì)分泌一些物質(zhì)(特別是有機(jī)酸)以適應(yīng)脅迫環(huán)境，其在環(huán)境污染和修復(fù)方面發(fā)揮著重要作用。磺胺類藥物(SAs)造成土壤污染，孔晶晶等［1］發(fā)現(xiàn)，磺胺氯噠嗪鈉、磺胺甲惡唑等磺胺類藥物的吸附能力隨土壤pH的升高而降低，與土壤中有機(jī)質(zhì)和含量呈正相關(guān)。朱斐雯等［2］發(fā)現(xiàn)，蘋果酸和乙酸是影響磺胺嘧啶在玉米根系土壤中降解的關(guān)鍵因素。有機(jī)酸影響著污染物從土壤向植物的遷移，對防止SAs類藥物經(jīng)由植物體吸收進(jìn)入人體危害人類健康具有重要意義。目前有機(jī)酸的測定通常采用氣相色譜法(GC)［3］、離子色譜法(IC)［4，10］、高效液相色譜法(HPLC)。而HPLC操作簡單、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，可同時(shí)定量測定多種有機(jī)酸，已獲得廣泛的應(yīng)用［5］。檢驗(yàn)環(huán)境中抗生素污染的方法主要有液相色譜分析法和色譜－質(zhì)譜聯(lián)用分析法［6，11］。本文建立了同時(shí)測定蔬菜中有機(jī)酸和SAs的高效液相色譜分析法，既為判斷植物性食品的品質(zhì)以及評價(jià)SAs隨植物性食品進(jìn)入食物鏈的風(fēng)險(xiǎn)提供了前提條件［7～9］，也為展開環(huán)境中有機(jī)酸的動(dòng)態(tài)變化、SAs降解等機(jī)理研究提供了理論支撐。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與材料

Agilent1290液相色譜系統(tǒng)(美國Agilent公司);H-1650臺式高速離心機(jī)(上海穗康公司);Milli-Q超純水制備系統(tǒng)(美國Millipore公司);StrataC18-E固相萃取小柱(3mL，Phenomenex)公司;HLB固相萃取小柱(3mL，Phenomenex公司)。7種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞99%，中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心);磺胺(SA)和磺胺二甲基嘧啶(SM2)標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞99%，上海阿拉丁公司);乙腈(色譜純);H3PO4，NaOH(AR);K2HPO4，(NH4)2HPO4標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞98.5%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司);實(shí)驗(yàn)用水均為超純水(18.2MΩ•cm)。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取草酸、蘋果酸、檸檬酸各500.0mg，富馬酸、α－酮戊二酸各50.0mg，用超純水溶解并定容至50mL;準(zhǔn)確量取乙酸2.0mL，丙酮酸100μL，用超純水定容至50mL;準(zhǔn)確稱取50mgSA，SM2標(biāo)準(zhǔn)品，溶于1mL0.05moL/LNaOH溶液，調(diào)節(jié)pH至中性，用超純水稀釋定容至50mL，配制成有機(jī)酸和磺胺類標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在4℃下避光保存，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要稀釋成不同濃度的工作溶液。

1.3樣品前處理

將青菜、菠菜葉片用超純水洗凈，擦干，剪碎混勻后各稱取2.50g，加入2.0mL提取液研磨勻漿，將均漿液全部移入50mL離心管中，再用1mL提取液洗滌并轉(zhuǎn)至離心管，重復(fù)3次，總體積為5mL，每組設(shè)置平行樣3個(gè)，30℃下振蕩提取30min，提取液于12000r/min轉(zhuǎn)速下離心20min，收集上清液，取上清液過0.22μm濾膜后，待測。

1.4色譜條件

色譜柱:PenomenexC18(150×4.6mm);柱溫:30℃;流動(dòng)相:A為0.5%(NH4)2HPO4-H3PO4(pH3)緩沖液，B為乙腈;流速為1mL/min;紫外檢測波長210，270nm;進(jìn)樣量20μL。洗脫梯度見表1。

2結(jié)果與討論

2.1色譜條件的優(yōu)化

2.1.1流動(dòng)相的選擇

分別采用乙酸－乙腈、KH2PO4－乙腈、(NH4)2HPO4溶液－乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行分析測定。結(jié)果表明，以乙酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰不能實(shí)現(xiàn)有效分離;以KH2PO4溶液為流動(dòng)相時(shí)，單個(gè)化合物出現(xiàn)雙峰;以(NH4)2HPO4為流動(dòng)相時(shí)有機(jī)酸和SAs都能得到較好的分離，色譜峰的峰形尖銳，對稱性好。因此，選擇(NH4)2HPO4為流動(dòng)相。配制了質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%的(NH4)2HPO4的溶液(用H3PO4調(diào)pH3)。色譜分離結(jié)果表明，當(dāng)(NH4)2HPO4溶液為0.5%時(shí)，有機(jī)酸和SAs均可獲得較好的分離效果和色譜峰形。因此本實(shí)驗(yàn)選擇0.5%(NH4)2HPO4溶液作為流動(dòng)相。

2.1.2流動(dòng)相pH、配比的選擇

用H3PO4分別調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH為2，2.5，3，3.5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相的pH變化直接影響化合物的分離效果，當(dāng)流動(dòng)相pH3時(shí)，各化合物獲得最佳分離效果。因此選擇pH3的(NH4)2HPO4溶液。考察了在磷酸鹽緩沖體系中加入有機(jī)相對有機(jī)酸和SAs的洗脫速度和分離度的影響。有機(jī)相中乙腈的含量越高，洗脫速度越快;磷酸鹽的含量越高洗脫速度越慢，分離度越高，因此可以調(diào)節(jié)乙腈和(NH4)2HPO4的比例將目標(biāo)峰在較短的時(shí)間分離。對于有機(jī)酸分離，選擇(NH4)2HPO4(0.5%，pH3):乙腈=100:0(V:V)作為流動(dòng)相時(shí)，7種有機(jī)酸在6min內(nèi)能實(shí)現(xiàn)完全分離，各組分間分離度大，峰形尖銳，且對稱性好。對于SAs的分離，選擇(NH4)2HPO4(0.5%，pH3):乙腈=15:85(V:V)作為流動(dòng)相時(shí)，使SA的出峰時(shí)間由12min縮短到7.4min，SM2出峰時(shí)間由24min縮短到20.7min。有機(jī)酸和SAs的標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖如圖1所示。

2.1.3檢測波長、柱溫和柱壓條件

通過紫外檢測器掃描了有機(jī)酸和SAs在190～400nm范圍內(nèi)的吸收，確定有機(jī)酸的最大吸收波長為210nm，SAs的最大吸收波長為270nm，因此，選擇檢測波長為210，270nm。選擇了25℃，30℃，35℃3個(gè)柱溫進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸和SAs的分離均不受柱溫變化的影響，綜合考慮確定柱溫箱溫度為30℃。本實(shí)驗(yàn)所用的HPLC色譜系統(tǒng)柱的最高壓限值為6MPa，為保持在合理范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)過程中流速控制在1mL/min，柱壓基本保持不變，范圍在2MPa左右。

2.2提取條件的選擇

2.2.1提取液

考察了蒸餾水、0.1%H3PO4溶液以及不同pH的磷酸鹽溶液對青菜和菠菜中有機(jī)酸和磺胺抗生素的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水提取和0.1%H3PO4溶液對青菜和菠菜中有機(jī)酸和SAs提取效果較好，而采用不同pH(pH2.2，3，5，6，7，8)的0.5%(NH4)2HPO4和0.5%KH2PO4為提取液時(shí)提取率均較低。以蒸餾水和0.1%H3PO4(pH2.2)為提取液時(shí)，有機(jī)酸的提取率無顯著差異，但蒸餾水直接提取的SAs回收率有所提高。因此，實(shí)驗(yàn)選擇蒸餾水作為提取液。

2.3標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度范圍為0.01～1000mg/L之間，設(shè)置10個(gè)濃度梯度，在上述色譜條件下進(jìn)行檢測，以質(zhì)量(x)與峰面積(y)進(jìn)行線性回歸，得出各有機(jī)酸和SAs的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表2)，相關(guān)系數(shù)R2＞0.9999，以3倍信噪比(S/N=3)求得7種有機(jī)酸的檢出限為0.21～1.95μg/kg，2種SAs的檢測限為0.82～1.08μg/kg，并以線性范圍的下限濃度作為本實(shí)驗(yàn)實(shí)測樣品的定量限。結(jié)果表明，有機(jī)酸和SAs分別在1～1000mg/L和0.01～1mg/L范圍內(nèi)線性良好，可滿足定量分析的要求。

2.4回收率和精確度

取相同的青菜樣品3組，其中1組作本底，測定各有機(jī)酸和SAs的含量;另外2組分別添加2個(gè)濃度水平的7種有機(jī)酸和2種SAs的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)后放置12h進(jìn)行老化平衡，按1.3節(jié)方法進(jìn)行前處理，每組樣品做6次平行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)加入標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度與檢出質(zhì)量濃度計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表3。

3結(jié)論

建立了一種同時(shí)測定蔬菜中有機(jī)酸和SAs的高效液相色譜法:7種有機(jī)酸和2種SAs在0.01～1000mg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)R2＞0.9999，有機(jī)酸的檢測限為0.21～1.95μg/kg，SAs的檢測限為0.82～1.08μg/kg，本方法準(zhǔn)確可靠，提高了靈敏度。分析結(jié)果表明，不同提取方法對不同試驗(yàn)材料的提取效果存在差異，綜合考慮發(fā)現(xiàn)采用蒸餾水直接提取的方法既能有效保證有機(jī)酸和SAs的提取量，又避免了不同的介質(zhì)提取帶來的實(shí)驗(yàn)誤差，調(diào)高了實(shí)驗(yàn)效率。加標(biāo)回收率試驗(yàn)表明，青菜中7種有機(jī)酸和2種SAs的回收率在81.2%～96.3%之間，RSD范圍為3.3%～8.6%，可用于蔬菜樣品中有機(jī)酸和SAs的檢測。針對市售青菜和菠菜檢測發(fā)現(xiàn)，蔬菜中SAs均有檢出，雖然其含量相對較低，但存在潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。

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作者:徐慧敏 施婷婷 檀華蓉 司雄元 單位:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科技中心