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枸杞子為茄科（Solanaceae）植物枸杞LyciumchinenseMill的成熟果實(shí)，是我國傳統(tǒng)的滋補(bǔ)中藥材?！侗静菥V目》中記載枸杞子具有堅(jiān)筋骨、補(bǔ)精氣諸不足、明目安神、令人長壽等功效［1］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，植物多糖具有抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效，已是當(dāng)前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［2～5］。目前人們對枸杞子多糖進(jìn)行了較廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)枸杞多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血脂、降血糖、抗疲勞、護(hù)肝、防輻射、抗缺氧等功效［6～8］，同時(shí)對多糖的分離與純化進(jìn)行了一些研究［9，10］，但對提取的工藝條件研究較少。本文對影響枸杞子多糖提取因素進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選出最佳的枸杞子多糖提取的工藝參數(shù)，同時(shí)進(jìn)行了枸杞子多糖的體外抗氧化活性研究，以期為研究開發(fā)枸杞子多糖新的藥物功能及保健食品提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
1材料與方法
1.1儀器與試劑上海尤尼柯儀器有限公司產(chǎn)WFJ2100型分光光度計(jì)；上海安亭精密儀器廠產(chǎn)TDL80-28臺式離心機(jī)；所用試劑均為分析純試劑。
1.2藥材枸杞子，原產(chǎn)寧夏，購于大連開發(fā)區(qū)。
1.3枸杞子多糖的提取
1.3.1枸杞子多糖提取的工藝流程及方法在參考已有其它種類多糖提取方法［11］的基礎(chǔ)上，利用水提的方法，采用正交實(shí)驗(yàn)對枸杞子多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以確立最佳工藝條件。枸杞子多糖提取的工藝流程見圖1。
圖1枸杞子提取工藝流程示意圖（略）
準(zhǔn)確稱取已于70℃烘干并粉碎的枸杞子2g于三角瓶中，按設(shè)計(jì)好的正交實(shí)驗(yàn)條件在恒溫水浴中進(jìn)行提取，然后將其以4000r/min離心18min，得上清液，經(jīng)濃縮，再加入5倍體積的乙醇，搖勻后，在4℃冰箱中放置過夜，以4000r/min離心20min。沉淀經(jīng)干燥后得到粗多糖。采用硫酸－苯酚法［11］測定所提取的枸杞子多糖中多糖含量，然后根據(jù)所用枸杞子的質(zhì)量（2g）計(jì)算出枸杞子中多糖得率。
1.3.2正交實(shí)驗(yàn)選用L9（33）正交實(shí)驗(yàn)，確定提取枸杞子多糖的最佳工藝參數(shù)，水平因素見表1。
表1正交水平（略）
1.3.3多糖含量測定采用硫酸-苯酚法測定提取的枸杞子多糖含量［11］，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.9988，線性方程為Y=0.007X。
由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品中多糖濃度，由下列公式計(jì)算樣品枸杞子中多糖含量。
多糖含量（%）=樣品濃度×稀釋倍數(shù)×樣品體積多糖試樣質(zhì)量×100%
枸杞子多糖得率（%）=計(jì)算測得多糖的質(zhì)量枸杞子樣品質(zhì)量（2g)×100%
1.4體外抗氧化活性［12］
1.4.1羥基自由基體系利用Eenton體系測定枸杞子多糖對亞鐵離子催化過氧化氫產(chǎn)生·OH的清除能力。由于·OH可特異地使番紅花紅褪色，根據(jù)褪色程度用比色法測量·OH含量。每支試管分別加入0.15mol/LpH=7.4磷酸緩沖液1.5ml，260μg/ml番紅花紅0.2ml。1.0mmol/LEDTA-Na2-Fe2+0.7ml，再分別加入一定濃度各級多糖試樣1.0ml,最后加入2％H2O20.8ml，混勻后于37℃水浴保溫30min?？瞻滓哉麴s水代替試樣，對照組則以蒸餾水代試樣和EDTA-Na2-Fe2+于520nm測吸光度值，并以Vc作對比。
清除率E（%）=（A樣品-A空白）/（A對照-A空白）×100﹪
1.4.2超氧陰離子體系采用鄰苯三酚自氧化法，在一定條件下，鄰苯三酚能夠自氧化產(chǎn)生·O2-，加入一定量的多糖液可對·O2-產(chǎn)生不同的抑制作用，進(jìn)而導(dǎo)致光吸收值的變化。取0.05mol/LpH8.2Tris-HCl緩沖液5ml于試管中，分別加入1ml一定濃度的各級多糖試樣液，置于25℃水浴中預(yù)熱20min，再加3mmol/L鄰苯三酚0.4ml，混勻，于25℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)4min，立即用濃HCl0.5ml終止反應(yīng)，并在320nm處測吸光度。空白對照組以相同體積Tris-HCl代替樣品，每個(gè)試管做3個(gè)平行，取平均值，按下式計(jì)算清除率。
清除率E（﹪）=（A對照-A樣品）/A對照×100%
2結(jié)果與討論
2.1枸杞子多糖提取
2.1.1正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果正交實(shí)驗(yàn)提取的枸杞子多糖得率見表2。
表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）
根據(jù)表2的極差分析可見，各因素對多糖得率的影響順序?yàn)椋築（溫度）＞C（提取時(shí)間）＞A（固液比），說明在各因素中，水提溫度對多糖提取率影響最大，然后是提取時(shí)間，最后是固液比。因素A，B以第2水平，C以第3水平為最好。因此，可確定枸杞多糖的提取優(yōu)化條件為A2B2C3，即最佳提取溫度為80℃，最佳提取時(shí)間為3.5h，最佳固液比為1∶30。
2.1.2多糖提取次數(shù)實(shí)驗(yàn)稱取枸杞子2g，按正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的最佳工藝條件分別提取3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。
表3不同提取次數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）
由表3可以看出，第1次和第2次提取多糖得率較多，而第3次提取多糖得率較少，多糖得率不足0.1%，所以提取次數(shù)可選為2次。
2.2體外抗氧化活性
2.2.1羥基自由基清除測定枸杞多糖對羥基自由基的清除能力，同時(shí)與相應(yīng)濃度的維生素C作對照,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。
圖1枸杞子多糖與維生素C清除羥基自由基結(jié)果（略）
由圖1可見，對羥基自由基的清除作用，枸杞多糖的清除效果要好于等質(zhì)量濃度的維生素C，當(dāng)多糖濃度達(dá)到229.5μg/ml時(shí)，其清除率達(dá)到48.1%,維生素C的清除率為41.2％。
2.2.2超氧陰離子清除測定枸杞多糖對超氧陰離子的清除能力，同時(shí)與等質(zhì)量濃度的維生素C的對照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。
由圖2可知，枸杞子多糖對超氧陰離子自由基的清除作用不明顯，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)其清除率隨著多糖濃度的增加非常緩慢，維生素C的清除效果明顯高于枸杞子多糖。當(dāng)多糖濃度為75.5μg/ml和229.5μg/ml時(shí)，其對超氧陰離子自由基的清除率為13.4%和13.5%，相應(yīng)濃度維生素C的清除率分別為36.5％和48.6％。
圖2枸杞子多糖與維生素C清除超氧陰離子結(jié)果（略）
3結(jié)論
由正交實(shí)驗(yàn)可見，在影響枸杞子多糖得率3個(gè)主要因素中，溫度的影響最顯著，其次為提取時(shí)間，最后為固液比。由正交實(shí)驗(yàn)可知,枸杞子多糖水浸提法提取的最佳工藝條件為提取溫度80℃，固液比1∶30，提取時(shí)間3.5h，提取次數(shù)為2次。在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，枸杞子多糖得率為8.34%。對枸杞子多糖抗氧化活性研究表明，枸杞子多糖對羥基自由基的清除效果較好，其清除率高于維生素C，而對超氧陰離子自由基的清除率低于維生素C，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，其清除能力不隨多糖濃度的增加而顯著增高。