基質層在暗背景下被襯托的細胞核范文

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【摘要】目的：用HRTⅡ代/Rostock角膜模塊對正常人眼角膜結構進行觀察和分析。方法：應用激光共焦顯微鏡對46例（92眼）正常人的中央角膜，上下方角膜緣進行檢查分析。結果：上下方角膜緣可觀察到Vogt柵欄狀結構，并可動態觀察到血細胞在血管內流動。上下方角膜緣表層上皮細胞密度低于中央表層上皮細胞（P<0.05）。Langerhans細胞（Lcs）位于角膜35~60μm處，其形態表現為細胞核較大且樹枝狀突起較多或者核較小且突起較少，可能分別代表Lcs處于成熟和未成熟狀態。Lcs平均密度角膜緣明顯高于角膜中央，角膜中央Lcs不可計數。正常人角膜上皮基底細胞下層神經排列較規則，平行走行，深層神經纖維較淺層神經纖維粗大，彎曲度小，少見分支，纖維之間的交聯很少，神經串珠清晰可見。角膜中央前基質細胞與后基質細胞平均密度相比較，差異有統計學意義（P<0.05）。角膜中央厚度為551±39μm。結論：激光共焦顯微鏡能在三維空間、實時、活體條件下對角膜組織進行無損傷的光學斷層掃描成像，觀察角膜各層細胞、神經及膠原等形態結構，并可研究其動態變化，具有廣闊的應用前景。

【關鍵詞】角膜Langerhans細胞激光共焦顯微鏡

海德堡視網膜斷層掃描系統Ⅱ代（HRTⅡ）是利用共聚焦激光的原理獲取和定量分析眼后節三維形態的儀器，通過增加Rostock角膜模塊組（RCM），HRTⅡ可以轉變成共焦激光角膜顯微鏡，用來獲取和分析角膜各層面二維圖像和整個角膜的三維圖像。我們應用HRTⅡ代/RCM檢查了92個正常人角膜，為進一步研究各種角膜疾病提供參考，現報告如下。

1對象和方法

1.1研究對象46例受檢者（92眼）來自2006年10月~2007年2月在南通大學附屬醫院眼科接受屈光手術術前檢查及常規體檢者，其中男20例，女26例，年齡20~61歲，平均38.3±10.9歲。所有受檢眼均無外傷、感染及配戴接觸鏡史，經裂隙燈顯微鏡檢查角膜透明，檢眼鏡檢查無異常。作為正常健康眼入選本研究。

1.2激光共焦顯微鏡檢查表面麻醉后滴50ulVidisic眼凝膠(美國博士倫公司生產)于物鏡頭表面，蓋上一次性無菌角膜接觸帽；移動固視燈令其向下看，在CCD攝取的監控圖像的指導下，調整物鏡位置直至激光光束位于上方角膜緣中央；前移物鏡至接觸帽與之輕微接觸，預設置兩者接觸的焦平面深度為0μm；轉動焦平面調節環以獲得角膜不同深度不同層次的圖像；根據所獲圖像的真實焦平面位置(深度用μm數表示)進行調整；移動固視燈改變被檢者注視方向，檢查上方角膜緣，中央角膜及結膜細胞；選擇有價值的圖像與錄像存盤。

1.3圖像分析與統計參數利用HRTII/RCM軟件分析系統，計算角膜各層細胞的平均密度。其中將角膜上皮分為3層：表層上皮細胞層、翼狀上皮細胞層（角膜基底上皮細胞層之前30μm處）和基底上皮細胞層，分別計算中央角膜及上下方角膜緣表層上皮細胞層，中央角膜翼狀上皮細胞層，基底上皮細胞層的細胞平均密度；將角膜基質層分為兩段，計算前基質層（近Bowman膜基質層），后基質層（近Descemet膜最后一層基質層）掃描圖像的細胞密度；分析角膜上皮基底細胞層下的神經，1幅圖像內所有神經纖維分支的總數量為神經數量(支／幅)；計算上下方角膜緣Langerhans細胞及中央角膜內皮細胞的平均密度；角膜厚度是指角膜接觸帽到內皮細胞之間的距離（μm）。

1.4統計學方法用Rostock操作軟件進行細胞計數，數據統計用x±s表示，每兩組細胞平均密度數值之間統計學差異應用配對t檢驗，以P<0.05作為差異有統計學意義。

2結果

共焦顯微鏡檢查的92眼中，獲得角膜中央上皮表層細胞圖像20眼（21.7％），獲得角膜緣表層上皮細胞圖像29眼（31.5％），獲得角膜緣Langerhans細胞圖像59眼（64.1％），獲得角膜中央Langerhans細胞圖像28眼（30.4％），獲得角膜上皮翼狀細胞層、基底細胞層、前基質層和后基質層圖像92眼(1O0.0％)，獲得內皮圖像90眼(97.8％)，對所有圖像進行形態學和細胞密度分析如下。

2.1上皮層正常的表層上皮細胞排列疏松，邊界清晰，呈多角形，以六邊形為主，胞核明亮。角膜中央表層上皮細胞平均密度為1124±290個/mm2，上下方角膜緣表層上皮細胞平均密度分別為847±302個/mm2和803±293個/mm2。上下方角膜緣表層上皮細胞密度相比較差異無統計學意義（t=0.98，P>0.05)，但低于中央表層上皮細胞（t=12.61，P<0.05）。翼狀細胞呈多角形，細胞向側面延伸變細，形似翼狀，邊界清晰，胞核反光較弱。角膜中央翼狀細胞層細胞平均密度為4279±270個/mm2。基底細胞近似圓形，排列緊密，邊界明亮，胞質和胞核反光弱。角膜中央基底細胞平均密度為6513±422個/mm2。

2.2角膜緣Vogt柵欄狀結構和Langerhans細胞用共焦顯微鏡可觀察到角膜緣Vogt柵欄狀結構：角膜緣上皮細胞層數增多向深層增生形成上皮柱，上皮柱之間的結締組織向上突起形成指狀突起，上皮柱和指狀突起有規律地交替排列。動態觀察到血細胞在血管內的流動。Langerhans細胞（Lcs）位于角膜35~60μm處，絕大多數Lcs位于基底上皮細胞層和前彈力層，少量Lcs位于翼狀上皮細胞層深部。其形態表現為細胞核較大且樹枝狀突起較多或者核較小且突起較少，可能分別代表Lcs處于成熟和未成熟狀態[1]。上方和下方角膜緣Lcs平均密度分別為184±25個/mm2，175±23個/mm2。兩者比較差異無統計學意義(t=1.15，P>0.05)。Lcs平均密度角膜緣明顯高于角膜中央，角膜中央Lcs不可計數。

2.3中央角膜上皮基底層下神經纖維Bowman膜在共焦顯微鏡下無形態及結構。正常人角膜上皮基底細胞下層神經排列比較規則，平行走行，淺層神經纖維彎曲度較大，神經纖維分支較多，深層神經纖維粗大，彎曲度小，少見分支，纖維之間的交聯很少，神經串珠清晰可見。中央角膜上皮基底層下神經纖維的數量為8.4±1.4支/幅。觀察視野為380μm×380μm。神經纖維叢旁邊偶見明亮的Langerhans細胞，細胞密度不可計數，形態不規則。

2.4基質層在圖像的暗背景下被襯托出發亮的細胞核，核間有不定形的黑色背景分割。細胞核形態為成骨細胞狀、紡錘狀及橢圓形，窺不清細胞胞漿、細胞邊緣及板層膠原。基質細胞的密度以Bowman膜下的最高。角膜中央前基質細胞平均密度為1130±96個/mm2，后基質細胞平均密度為778±53個/mm2。兩者之間細胞密度差異有統計學意義（t=10.89,P<0.05）。另外，在前中基質層可見粗大的分支狀的神經干。

2.5內皮細胞層及角膜厚度角膜內皮細胞(圖9)呈六邊形，細胞邊界呈黑色，胞體明亮，看不到胞核。與角膜內皮鏡檢查時的細胞形態相同，細胞密度越大者，六邊形形態規則占的比例越大；反之，細胞六邊形越少，不規則形細胞比例增大。角膜中央內皮細胞平均密度為3128±324個/mm2。角膜中央厚度為551±39μm。