法醫(yī)體液溯源分子生物學(xué)技術(shù)研究范文

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【摘要】通過(guò)對(duì)犯罪現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)的體液溯源，可以在樣本來(lái)源者與實(shí)際犯罪行為之間建立聯(lián)系，為現(xiàn)場(chǎng)重建提供重要證據(jù)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA甲基化、RNA等遺傳標(biāo)記以及特定微生物檢測(cè)被發(fā)現(xiàn)具有潛在的法醫(yī)體液溯源價(jià)值。本文對(duì)近年來(lái)應(yīng)用分子生物學(xué)方法進(jìn)行法醫(yī)體液溯源的研究現(xiàn)狀和應(yīng)用前景進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】法醫(yī)物證學(xué)；體液鑒別；DNA甲基化；RNAs；法醫(yī)微生物

體液斑痕，如血痕、精斑、唾液斑等，是犯罪現(xiàn)場(chǎng)最常見(jiàn)的生物物證檢材。明確生物斑痕的組織/體液來(lái)源，能夠?yàn)榇_定案件性質(zhì)、進(jìn)行犯罪現(xiàn)場(chǎng)重建提供重要證據(jù)。傳統(tǒng)的體液識(shí)別主要應(yīng)用血清學(xué)和免疫學(xué)方法，檢測(cè)體液斑中特定的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記，檢材消耗量大，靈敏度和特異性各異，且通常一次實(shí)驗(yàn)僅能分析一種體液。物理學(xué)方法如交替光源法、拉曼光譜法等，對(duì)檢材無(wú)損耗，但方法的可重復(fù)性、識(shí)別多個(gè)樣本及混合樣本的能力還有待考量。近年來(lái)，基于DNA甲基化水平、不同類型RNA表達(dá)水平差異以及特定微生物分析進(jìn)行體液識(shí)別的分子生物學(xué)技術(shù)得到廣泛的關(guān)注。

1DNA

甲基化差異在體液溯源中應(yīng)用潛能DNA甲基化是細(xì)胞控制基因表達(dá)的表觀遺傳機(jī)制之一。提取的DNA中，甲基化可被保留。全基因組DNA甲基化分析表明，哺乳動(dòng)物基因組中存在很多組織特異性差異甲基化區(qū)域（tissuespecificdifferentiallymethylatedregions，TDMR）[1]，這使DNA甲基化成為潛在的組織/體液鑒別分子標(biāo)記。2011年Dan等[2]報(bào)道了15個(gè)在血液（靜脈血/月經(jīng)血）、唾液、精液、皮膚上皮、尿液及陰道分泌物間表現(xiàn)出差異甲基化的基因位點(diǎn)。2014年，Park等[3]應(yīng)用芯片篩選出2986個(gè)候選區(qū)域，從中挑選了8個(gè)甲基化位點(diǎn)（血液：cg06379435和cg08792630；唾液：cg26107890和cg20691722；精液：cg23521140和cg17610929；陰道分泌物：cg01774894和cg14991487）應(yīng)用焦磷酸測(cè)序方法進(jìn)行評(píng)估，所有位點(diǎn)在體液鑒別中均表現(xiàn)出高特異性及高靈敏度。2015年，Lee等[4]同樣應(yīng)用芯片篩選出與Park等[3]的研究不完全相同的64個(gè)CpG位點(diǎn)，同時(shí)建立了基于SNaPshot方法的包含8個(gè)位點(diǎn)的復(fù)合檢測(cè)體系，可以區(qū)分血液、唾液、精液和陰道分泌物；隨后的研究又加入了位于SLC26A10基因啟動(dòng)子區(qū)的兩個(gè)月經(jīng)血特異性甲基化位點(diǎn)cg09696411和cg18069290[5]。DNA甲基化檢測(cè)可以與法醫(yī)常用的以DNA為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)方法（如DNA提取，PCR法及DNA分型）相兼容，與傳統(tǒng)方法相比，具有較高的特異性及靈敏度。DNA較RNA更穩(wěn)定，更適于對(duì)高度降解檢材或陳舊檢材進(jìn)行體液溯源。但甲基化水平易受年齡、疾病等因素影響，篩選更多的DNA甲基化標(biāo)記及對(duì)已有標(biāo)記的驗(yàn)證還需要進(jìn)一步探究。

2體液特異

mRNA是目前最成熟分子標(biāo)志物應(yīng)用信使RNA(messengerRNA，mRNA)進(jìn)行組織/體液溯源較甲基化研究開(kāi)展得更早。目前已有不同實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了多個(gè)用于法醫(yī)相關(guān)體液識(shí)別的mRNA，其中五種常見(jiàn)體液的特異性mRNA總結(jié)如表1[6-8]。歐洲D(zhuǎn)NA分型工作組（theEruopeanDNAprofilinggroup,EDNAP）針對(duì)基于毛細(xì)管電泳技術(shù)的mRNA檢測(cè)方法和DNA/RNA共提取技術(shù)已進(jìn)行數(shù)次合作研究。最近，已有研究者將二代測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于組織/體液特異性mRNA檢測(cè)。Zubakov等[9]建立了一種基于IonTorrentPGM平臺(tái)的檢測(cè)方法，能同時(shí)分型9種常染色體STR、牙釉蛋白基因及12種mRNA，在個(gè)體識(shí)別的同時(shí)實(shí)現(xiàn)樣本組織/體液類型鑒別。Hanson等[10]構(gòu)建了包含33種mRNA的二代測(cè)序方法，用于鑒別6種法醫(yī)常見(jiàn)組織/體液，通過(guò)偏最小二乘法和線性判別式法分析該體系的測(cè)序數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本來(lái)源的預(yù)測(cè)分類[11]。同時(shí)，歐洲法醫(yī)遺傳學(xué)合作網(wǎng)絡(luò)（EuropeanForensicGeneticsNetworkofExcellence，EUROFORGEN-NoE）聯(lián)合EDNAP針對(duì)該體系進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室評(píng)估[12]。mRNA的穩(wěn)定性制約著其在法醫(yī)檢案中的普遍應(yīng)用。強(qiáng)紫外光、高溫、潮濕，尤其是環(huán)境中無(wú)處不在的核糖核酸酶等因素都會(huì)使mRNA很快降解。但也有研究報(bào)道某些體液特異性mRNA在保存幾年[6]甚至幾十年[13]的陳舊樣本中依舊能被檢測(cè)到，這大大增加了mRNA在法醫(yī)實(shí)踐中的應(yīng)用價(jià)值。

3新興非編碼

RNA可成為轉(zhuǎn)錄水平體液鑒別候選標(biāo)記非編碼RNA（non-codingRNA，ncRNA）是指相對(duì)于具有翻譯功能的mRNA而言，不編碼蛋白質(zhì)的一類RNA。近年來(lái)不同種類的ncRNA逐漸被發(fā)現(xiàn)并得到研究。某些ncRNA在不同類型的組織細(xì)胞中具有特異性表達(dá)的特征。在法醫(yī)領(lǐng)域較受關(guān)注的主要有微小RNA（microRNA/miRNA）和環(huán)狀RNA（circularRNA，circRNA）。3.1miRNAmiRNA是一類小的ncRNA，長(zhǎng)度為18-25nt，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。與mRNA相比，miRN段短小，相對(duì)穩(wěn)定。迄今為止，miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)已收錄28589條miRNA。miRNA在不同組織中具有特異性的表達(dá)譜，可成為法醫(yī)體液鑒別的候選遺傳標(biāo)記。2009年，Hanson等[14]首次評(píng)估了miRNA在不同體液斑中的表達(dá)譜，并篩選出9種miRNA（miR451、miR16、miR135b、miR10b、miR658、miR205、miR124a、miR372、miR412）用以區(qū)分血液、精液、唾液、陰道分泌物和月經(jīng)血。2010年，Zubakov等[15]利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)718種miRNA在五種常見(jiàn)體液中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)了4種血液特異性miRNA（miR-20a、miR-106a、miR-185、miR-144）和5種精液特異性miRNA（miR-135a、miR-10a、miR-507、miR-943、miR-891a）；同時(shí)，其對(duì)Hanson等報(bào)道的候選miRNA進(jìn)行驗(yàn)證的結(jié)果顯示，除血液和精液外，其余體液特異性miRNA均不能被重復(fù)。Wang等[16]應(yīng)用TaqMan®ArrayHumanMicroRNACards檢測(cè)了754種已知人類miRNA在不同體液中的表達(dá)水平，最終篩選出miR16（血液），miR486、miR888（精液）和miR891a、miR214（月經(jīng)血）分別作為以上三種體液的分子標(biāo)記。2016年該課題組利用IonPGMTMSystem平臺(tái)分析了miRBasev21數(shù)據(jù)庫(kù)中的2588種成熟miRNA在血液及唾液樣本中的表達(dá)及分布情況，并篩選出6種血液特異性miRNA和19種唾液特異性miRNA[17]。miRNA的表達(dá)水平易受疾病[18]等因素影響，聯(lián)合應(yīng)用多種miRNA能提高鑒別的精準(zhǔn)度。另外，不同實(shí)驗(yàn)室即使應(yīng)用相同的技術(shù)進(jìn)行miRNA位點(diǎn)的篩選及驗(yàn)證，結(jié)果也不盡相同，這可能與檢測(cè)方法和對(duì)結(jié)果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。3.2circRNAcircRNA是一類新型的ncRNA，是RNA經(jīng)過(guò)反向剪接形成的單鏈共價(jià)閉合環(huán)狀分子，無(wú)5'末端帽子及3'末端poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)。迄今為止，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)circRNA在多種組織和體液（如睪丸（15996種）[19]，唾液（約400種）[20]等）中種類豐富。值得注意的是RNaseR、RNaseⅡ、多核苷酸磷酸化酶、寡核糖核酸酶等常見(jiàn)核酸酶均不能有效水解circRNA。由于circRNA相對(duì)穩(wěn)定，臨床上多被用來(lái)研究作為疾病診斷的分子標(biāo)志物。circRNA同樣具有組織特異性。2016年Xia等[21]篩選出人和鼠基因中302853種組織特異性circRNA。Dong等[19]利用高通量測(cè)序篩選出60種circRNA，經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)了10種睪丸特異性circRNA，其來(lái)源基因?yàn)長(zhǎng)RWD1、STK31、HIST1H2BA、RNF17、BRDT、SMC1B和SPATA16。Bahn[20]等利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)唾液中細(xì)胞外circRNA進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)circRNA具有細(xì)胞外功能并可能作為唾液的一類分子標(biāo)志物。基于以上特點(diǎn)，circRNA可能成為法醫(yī)組織/體液鑒別新興的候選標(biāo)記。近幾年已有研究者在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)ircRNA進(jìn)行相關(guān)探索。Song等[22]利用芯片技術(shù)檢測(cè)了五種法醫(yī)相關(guān)體液中的circRNA，發(fā)現(xiàn)精液、唾液和靜脈血的表達(dá)譜相對(duì)特異，而月經(jīng)血與陰道分泌物表現(xiàn)出相似的特征。Zhang等[23]檢測(cè)了外周血和月經(jīng)血（取自月經(jīng)周期1-3天）中來(lái)源基因?yàn)锳LAS2和MMP7的mRNA及circRNA，發(fā)現(xiàn)在分型mRNA的同時(shí)檢測(cè)相同基因來(lái)源的circRNA，可提高檢測(cè)的靈敏度及穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)室近期已通過(guò)二代測(cè)序及qRT-PCR方法篩選出4種僅在月經(jīng)血中表達(dá)的circRNA，可用于法醫(yī)外周血與月經(jīng)血鑒別。

4人體微生物群落分布有助區(qū)分特定體液

人體不同部位有不同的微生物群落，而某些微生物只存在于特定體液中。Giampaoli等[24]的研究表明，女性生殖道細(xì)菌、鏈球菌和腸球菌分別在陰道、口腔和糞便中顯示出特異性信號(hào)。Zou等[25]分析了中國(guó)漢族人群中以上三種檢材的微生物菌群特征，認(rèn)為詹氏乳桿菌、卷曲乳桿菌及單行擬桿菌、多型類桿菌可有效區(qū)分陰道液和糞便。離體檢材中微生物的種類和數(shù)量會(huì)因其本身的生長(zhǎng)和降解、環(huán)境中微生物的滋生而發(fā)生變化，同時(shí)疾病的發(fā)生、抗生素的使用也會(huì)影響體內(nèi)微生物的菌群特征，應(yīng)用微生物群落分布規(guī)律進(jìn)行體液推斷還需結(jié)合多方因素綜合分析。

5總結(jié)與展望

對(duì)遺留在犯罪現(xiàn)場(chǎng)的體液來(lái)源進(jìn)行鑒別有助于還原案件事實(shí)，在法醫(yī)實(shí)踐中具有重要意義。應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)在一次檢測(cè)中分析多種體液特異性遺傳標(biāo)記，避免浪費(fèi)有限的現(xiàn)場(chǎng)檢材。但無(wú)論是DNA甲基化、轉(zhuǎn)錄水平遺傳標(biāo)記還是特定微生物菌群的檢測(cè)結(jié)果，均易受年齡、疾病、環(huán)境等因素影響，需要多手段、多維度聯(lián)合解讀。隨著相關(guān)研究的逐步深入，新的特異性標(biāo)志物被不斷發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)技術(shù)及分析理論日趨完善，未來(lái)有望建立統(tǒng)一規(guī)范的體液溯源法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)流程和判定標(biāo)準(zhǔn)，以科學(xué)客觀的鑒定結(jié)論協(xié)助刻畫犯罪行為過(guò)程，充分發(fā)揮生物物證在司法審判中的作用。

作者：石珂 李淑瑾 付麗紅 張曉靜 付光平 王茜 叢斌 單位：河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院