法醫(yī)體液溯源分子生物學技術研究范文

本站小編為你精心準備了法醫(yī)體液溯源分子生物學技術研究參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發(fā)您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

【摘要】通過對犯罪現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)的體液溯源，可以在樣本來源者與實際犯罪行為之間建立聯(lián)系，為現(xiàn)場重建提供重要證據(jù)。隨著分子生物學技術的發(fā)展，DNA甲基化、RNA等遺傳標記以及特定微生物檢測被發(fā)現(xiàn)具有潛在的法醫(yī)體液溯源價值。本文對近年來應用分子生物學方法進行法醫(yī)體液溯源的研究現(xiàn)狀和應用前景進行綜述。

【關鍵詞】法醫(yī)物證學；體液鑒別；DNA甲基化；RNAs；法醫(yī)微生物

體液斑痕，如血痕、精斑、唾液斑等，是犯罪現(xiàn)場最常見的生物物證檢材。明確生物斑痕的組織/體液來源，能夠為確定案件性質(zhì)、進行犯罪現(xiàn)場重建提供重要證據(jù)。傳統(tǒng)的體液識別主要應用血清學和免疫學方法，檢測體液斑中特定的蛋白質(zhì)分子標記，檢材消耗量大，靈敏度和特異性各異，且通常一次實驗僅能分析一種體液。物理學方法如交替光源法、拉曼光譜法等，對檢材無損耗，但方法的可重復性、識別多個樣本及混合樣本的能力還有待考量。近年來，基于DNA甲基化水平、不同類型RNA表達水平差異以及特定微生物分析進行體液識別的分子生物學技術得到廣泛的關注。

1DNA

甲基化差異在體液溯源中應用潛能DNA甲基化是細胞控制基因表達的表觀遺傳機制之一。提取的DNA中，甲基化可被保留。全基因組DNA甲基化分析表明，哺乳動物基因組中存在很多組織特異性差異甲基化區(qū)域（tissuespecificdifferentiallymethylatedregions，TDMR）[1]，這使DNA甲基化成為潛在的組織/體液鑒別分子標記。2011年Dan等[2]報道了15個在血液（靜脈血/月經(jīng)血）、唾液、精液、皮膚上皮、尿液及陰道分泌物間表現(xiàn)出差異甲基化的基因位點。2014年，Park等[3]應用芯片篩選出2986個候選區(qū)域，從中挑選了8個甲基化位點（血液：cg06379435和cg08792630；唾液：cg26107890和cg20691722；精液：cg23521140和cg17610929；陰道分泌物：cg01774894和cg14991487）應用焦磷酸測序方法進行評估，所有位點在體液鑒別中均表現(xiàn)出高特異性及高靈敏度。2015年，Lee等[4]同樣應用芯片篩選出與Park等[3]的研究不完全相同的64個CpG位點，同時建立了基于SNaPshot方法的包含8個位點的復合檢測體系，可以區(qū)分血液、唾液、精液和陰道分泌物；隨后的研究又加入了位于SLC26A10基因啟動子區(qū)的兩個月經(jīng)血特異性甲基化位點cg09696411和cg18069290[5]。DNA甲基化檢測可以與法醫(yī)常用的以DNA為基礎的實驗方法（如DNA提取，PCR法及DNA分型）相兼容，與傳統(tǒng)方法相比，具有較高的特異性及靈敏度。DNA較RNA更穩(wěn)定，更適于對高度降解檢材或陳舊檢材進行體液溯源。但甲基化水平易受年齡、疾病等因素影響，篩選更多的DNA甲基化標記及對已有標記的驗證還需要進一步探究。

2體液特異

mRNA是目前最成熟分子標志物應用信使RNA(messengerRNA，mRNA)進行組織/體液溯源較甲基化研究開展得更早。目前已有不同實驗室報道了多個用于法醫(yī)相關體液識別的mRNA，其中五種常見體液的特異性mRNA總結如表1[6-8]。歐洲DNA分型工作組（theEruopeanDNAprofilinggroup,EDNAP）針對基于毛細管電泳技術的mRNA檢測方法和DNA/RNA共提取技術已進行數(shù)次合作研究。最近，已有研究者將二代測序技術應用于組織/體液特異性mRNA檢測。Zubakov等[9]建立了一種基于IonTorrentPGM平臺的檢測方法，能同時分型9種常染色體STR、牙釉蛋白基因及12種mRNA，在個體識別的同時實現(xiàn)樣本組織/體液類型鑒別。Hanson等[10]構建了包含33種mRNA的二代測序方法，用于鑒別6種法醫(yī)常見組織/體液，通過偏最小二乘法和線性判別式法分析該體系的測序數(shù)據(jù)，實現(xiàn)對樣本來源的預測分類[11]。同時，歐洲法醫(yī)遺傳學合作網(wǎng)絡（EuropeanForensicGeneticsNetworkofExcellence，EUROFORGEN-NoE）聯(lián)合EDNAP針對該體系進行了實驗室評估[12]。mRNA的穩(wěn)定性制約著其在法醫(yī)檢案中的普遍應用。強紫外光、高溫、潮濕，尤其是環(huán)境中無處不在的核糖核酸酶等因素都會使mRNA很快降解。但也有研究報道某些體液特異性mRNA在保存幾年[6]甚至幾十年[13]的陳舊樣本中依舊能被檢測到，這大大增加了mRNA在法醫(yī)實踐中的應用價值。

3新興非編碼

RNA可成為轉錄水平體液鑒別候選標記非編碼RNA（non-codingRNA，ncRNA）是指相對于具有翻譯功能的mRNA而言，不編碼蛋白質(zhì)的一類RNA。近年來不同種類的ncRNA逐漸被發(fā)現(xiàn)并得到研究。某些ncRNA在不同類型的組織細胞中具有特異性表達的特征。在法醫(yī)領域較受關注的主要有微小RNA（microRNA/miRNA）和環(huán)狀RNA（circularRNA，circRNA）。3.1miRNAmiRNA是一類小的ncRNA，長度為18-25nt，參與轉錄后基因表達調(diào)控。與mRNA相比，miRN段短小，相對穩(wěn)定。迄今為止，miRNA數(shù)據(jù)庫已收錄28589條miRNA。miRNA在不同組織中具有特異性的表達譜，可成為法醫(yī)體液鑒別的候選遺傳標記。2009年，Hanson等[14]首次評估了miRNA在不同體液斑中的表達譜，并篩選出9種miRNA（miR451、miR16、miR135b、miR10b、miR658、miR205、miR124a、miR372、miR412）用以區(qū)分血液、精液、唾液、陰道分泌物和月經(jīng)血。2010年，Zubakov等[15]利用基因芯片技術檢測718種miRNA在五種常見體液中的表達情況，發(fā)現(xiàn)了4種血液特異性miRNA（miR-20a、miR-106a、miR-185、miR-144）和5種精液特異性miRNA（miR-135a、miR-10a、miR-507、miR-943、miR-891a）；同時，其對Hanson等報道的候選miRNA進行驗證的結果顯示，除血液和精液外，其余體液特異性miRNA均不能被重復。Wang等[16]應用TaqMan®ArrayHumanMicroRNACards檢測了754種已知人類miRNA在不同體液中的表達水平，最終篩選出miR16（血液），miR486、miR888（精液）和miR891a、miR214（月經(jīng)血）分別作為以上三種體液的分子標記。2016年該課題組利用IonPGMTMSystem平臺分析了miRBasev21數(shù)據(jù)庫中的2588種成熟miRNA在血液及唾液樣本中的表達及分布情況，并篩選出6種血液特異性miRNA和19種唾液特異性miRNA[17]。miRNA的表達水平易受疾病[18]等因素影響，聯(lián)合應用多種miRNA能提高鑒別的精準度。另外，不同實驗室即使應用相同的技術進行miRNA位點的篩選及驗證，結果也不盡相同，這可能與檢測方法和對結果的評價標準不同有關。3.2circRNAcircRNA是一類新型的ncRNA，是RNA經(jīng)過反向剪接形成的單鏈共價閉合環(huán)狀分子，無5'末端帽子及3'末端poly(A)尾巴結構。迄今為止，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)circRNA在多種組織和體液（如睪丸（15996種）[19]，唾液（約400種）[20]等）中種類豐富。值得注意的是RNaseR、RNaseⅡ、多核苷酸磷酸化酶、寡核糖核酸酶等常見核酸酶均不能有效水解circRNA。由于circRNA相對穩(wěn)定，臨床上多被用來研究作為疾病診斷的分子標志物。circRNA同樣具有組織特異性。2016年Xia等[21]篩選出人和鼠基因中302853種組織特異性circRNA。Dong等[19]利用高通量測序篩選出60種circRNA，經(jīng)qRT-PCR驗證后發(fā)現(xiàn)了10種睪丸特異性circRNA，其來源基因為LRWD1、STK31、HIST1H2BA、RNF17、BRDT、SMC1B和SPATA16。Bahn[20]等利用二代測序技術對唾液中細胞外circRNA進行研究，發(fā)現(xiàn)circRNA具有細胞外功能并可能作為唾液的一類分子標志物。基于以上特點，circRNA可能成為法醫(yī)組織/體液鑒別新興的候選標記。近幾年已有研究者在法醫(yī)學領域對circRNA進行相關探索。Song等[22]利用芯片技術檢測了五種法醫(yī)相關體液中的circRNA，發(fā)現(xiàn)精液、唾液和靜脈血的表達譜相對特異，而月經(jīng)血與陰道分泌物表現(xiàn)出相似的特征。Zhang等[23]檢測了外周血和月經(jīng)血（取自月經(jīng)周期1-3天）中來源基因為ALAS2和MMP7的mRNA及circRNA，發(fā)現(xiàn)在分型mRNA的同時檢測相同基因來源的circRNA，可提高檢測的靈敏度及穩(wěn)定性。本實驗室近期已通過二代測序及qRT-PCR方法篩選出4種僅在月經(jīng)血中表達的circRNA，可用于法醫(yī)外周血與月經(jīng)血鑒別。

4人體微生物群落分布有助區(qū)分特定體液

人體不同部位有不同的微生物群落，而某些微生物只存在于特定體液中。Giampaoli等[24]的研究表明，女性生殖道細菌、鏈球菌和腸球菌分別在陰道、口腔和糞便中顯示出特異性信號。Zou等[25]分析了中國漢族人群中以上三種檢材的微生物菌群特征，認為詹氏乳桿菌、卷曲乳桿菌及單行擬桿菌、多型類桿菌可有效區(qū)分陰道液和糞便。離體檢材中微生物的種類和數(shù)量會因其本身的生長和降解、環(huán)境中微生物的滋生而發(fā)生變化，同時疾病的發(fā)生、抗生素的使用也會影響體內(nèi)微生物的菌群特征，應用微生物群落分布規(guī)律進行體液推斷還需結合多方因素綜合分析。

5總結與展望

對遺留在犯罪現(xiàn)場的體液來源進行鑒別有助于還原案件事實，在法醫(yī)實踐中具有重要意義。應用分子生物學技術，能夠實現(xiàn)在一次檢測中分析多種體液特異性遺傳標記，避免浪費有限的現(xiàn)場檢材。但無論是DNA甲基化、轉錄水平遺傳標記還是特定微生物菌群的檢測結果，均易受年齡、疾病、環(huán)境等因素影響，需要多手段、多維度聯(lián)合解讀。隨著相關研究的逐步深入，新的特異性標志物被不斷發(fā)現(xiàn)，檢測技術及分析理論日趨完善，未來有望建立統(tǒng)一規(guī)范的體液溯源法醫(yī)實驗室檢測流程和判定標準，以科學客觀的鑒定結論協(xié)助刻畫犯罪行為過程，充分發(fā)揮生物物證在司法審判中的作用。

作者：石珂 李淑瑾 付麗紅 張曉靜 付光平 王茜 叢斌 單位：河北醫(yī)科大學法醫(yī)學院