分子診斷學技術的檢驗醫學發展論文范文

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1常用的分子診斷技術

1.1基因擴增技術1983年美國Cetus公司的Mullis發明了聚合酶鏈反應技術(polymerasechainreaction,PCR)，該技術利用DNA高溫變性和低溫復性的原理，通過變性、復性和延伸3個溫度變化，成功實現核酸片段的體外擴增。PCR技術以其特異性高、靈敏度高、簡便、快速，對標本的純度要求低等優點，被廣泛應用到醫學、農業、食品檢驗等領域。PCR技術分為兩種：常規PCR技術和實時PCR技術。常規PCR技術，指僅對PCR擴增反應的終點產物進行定性或半定量分析，無法對起始模板準確定量，也無法對擴增反應實時檢測的一項核酸擴增技術，但該技術所需技術平臺和儀器設備較低，花費成本相對也低，目前臨床上主要運用該平臺對定性項目進行檢測，例如：缺失基因、突變基因、融合基因等的檢測。實時PCR技術，又稱實時定量熒光PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的技術。實時PCR技術，具有特異性強、準確度高、重復性好等特點，在檢驗醫學上主要應用于核酸定量、mRNA表達水平分析等，可以分析和指導臨床用藥、監測藥物療效、判斷病情進展。

1.2基因測序技術1977年Maxam提出了化學修飾降解法模型，為核酸測序時代的到來拉開序幕。同年，Sanger等發明了DNA雙脫氧鏈末端終止法，可以檢測物種或細胞的核酸序列，再與基因庫進行比對，從而知道被檢測物種或細胞的特性。Sanger法作為最經典的測序方法，讀取序列長，能夠較好地處理重復序列和多聚體，仍為目前常用的測序方法，廣泛應用于基因組DNA、cDNA等多重復序列的檢測。該技術不足之處：靈敏度較低，通量較低。1998年Ronaghi發明了焦磷酸測序法，其基本原理是利用引物延伸時所釋放的焦磷酸基團激發熒光，通過峰值高低判斷與其匹配的堿基數量。比起Sanger法，提高了靈敏度，在SNP位點檢測、等位基因突變測定等廣泛運用。近幾年，發明了高通量測序技術，是對傳統技術的一次革命性的創新。該技術通過DN段化構建DNA文庫、文庫與載體交聯進行擴增、在載體面上進行邊合成邊測序反應，完成對海量數據的高通量測序。該技術測序速度快、準確度高，可以進行大規模的測序檢測，主要應用于全基因組序列、內含子序列、外顯子序列等的分析和研究。

2分子診斷學技術在檢驗醫學中的應用

分子診斷就是應用分子生物學技術，在遺傳物質的結構或表達水平，通過檢測特定基因存在、轉錄及表達異常，對人體狀態和疾病作出診斷的方法。分子診斷學在檢驗醫學中的應用，使越來越多的疾病的發生發展的分子機制得到闡明，為臨床醫生對疾病的診斷、治療和預后，提供最為直接、最為準確的依據。目前分子診斷學技術在感染性疾病和遺傳性疾病中的應用最為廣泛。

2.1分子診斷學技術在感染性疾病的應用感染性疾病是指外源病原體入侵機體后，生物體無法排除該病原體而產生一系列不適的反應。一般通過病原體培養或血清學方法進行病因查找。酶聯免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)是目前檢驗醫學實驗室檢測免疫學指標應用最廣泛的方法之一，廣泛應用于乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋病等感染性疾病的診斷檢測和診斷，具有靈敏度高、特異性強、快速簡便等優點，但是一些影響因素不容小覷，臨床待檢標本常受溶血、黃疸、脂濁等因素的影響，導致檢測結果判斷錯誤。血清學也只能確定機體是否接觸病原體，不判斷是否是現行感染。PCR和基因芯片技術應用于病原微生物的檢測，具有敏感性高、耗時少、效率高等優點。例如：利用實時熒光定量PCR技術檢測乙肝病毒DNA的載量，與傳統的酶聯免疫法相比，既可以提示疾病的嚴重程度，也可以監測藥物療效、預后與復發。分子診斷學技術在感染性疾病的應用，可彌補血清學檢測技術的缺陷，主要包括以下幾個方面：(1)檢查不能培養或生長緩慢的病原微生物；(2)通過病原微生物的定量檢查監測病情；(3)微生物耐藥性的檢查；(4)細菌分型及流行病學調查。

2.2分子診斷學技術在遺傳性疾病中的應用遺傳性疾病是指遺傳因素占主要發病原因的某些疾病，幾乎都存在一定的基因缺失或突變。分子診斷學技術是指通過分析患者體內遺傳物質結構或表達水平的變化，對人體健康狀態和疾病作出或輔助診斷的方法。分子診斷學技術已經能夠診斷已知致病基因的遺傳性疾病，對一些基因突變所致的遺傳病也有良好的診斷意義，也能利用遺傳標志來診斷一些病因未明的疾病。例如，鐮狀細胞貧血：β-珠蛋白基因中第6位密碼子的序列由原來的GAG改變為GTG，編碼的血紅蛋白為鐮狀細胞血紅蛋白。通過PCR技術可以將包含突變位點的β-珠蛋白基因片段擴增，根據產物分析的結果可以對該遺傳性疾病進行診斷。基于基因芯片技術，對基因SNP進行分型，檢測遺傳性耳聾基因，發現50%的兒童期耳聾與遺傳因素有關。采用序列特異性引物聚合酶反應(polymerasechainreac-tionwithsequencespecificprimer,PCR-SSP)技術對白介素18基因啟動子區-607C/A、-137G/C基因型多態性進行分析，從而發現該基因啟動子區-607C/A、-137G/C多態性與江西人群哮喘未見相關性。利用高通量測序技術，結合生物信息學，可以準確預測胎兒發生某些遺傳性疾病的風險，從而達到降低畸形兒出生率的目的，例如：21-三體綜合征(唐氏綜合征)、18-三體綜合征(愛德華綜合征)等。

3現狀和挑戰

分子診斷以PCR為基礎，自從發明以來，廣泛地應用于疾病診斷、療效檢測和預后判斷，有力推動了檢驗醫學的發展，開辟了檢驗醫學的新領域，給檢驗醫學帶來機遇與挑戰。在美國和歐洲等發達國家，分子診斷已經成為了醫療診斷不可或缺的重要組成部分，為人民的健康保駕護航發揮重要的作用。國內的分子診斷學技術在檢驗醫學中的應用，雖取得一定程度的發展，但是始終落后臨床的發展，難以滿足臨床診斷的要求，分子診斷項目開展較少，重視程度不夠，應用緩慢。以下從兩方面分析我國分子診斷學技術應用于檢驗醫學的現狀及存在的問題。

3.1分子診斷檢測平臺現在檢驗醫學的發展方向是自動化和一體化，分子診斷學技術努力實現檢測儀器、試劑和校準品的一體化，從而避免實驗室之間結果的差異。我國的分子診斷在檢驗醫學中的應用平臺，還處在起步階段，實現自動化尚需時日。目前我國在核酸提取、擴增反應系統準備、擴增前加樣、上機、產物和結果分析等方面仍是以手工操作為主。歐美國家基本上采用自動化核酸提取系統，既可以提高工作效率，減少生物暴露時間，還避免操作人員個體差異對實驗結果的影響，提高結果的可重復性和準確性。目前我國應用于檢驗醫學的主流分子診斷學技術是實時熒光PCR技術，主要用于感染性疾病病原體核酸的檢測，而歐美發達國家，檢測平臺較為多樣，主流技術為測序，分子診斷涵蓋了感染性疾病、遺傳性疾病、腫瘤等領域。

3.2技術人員的水平與能力分子診斷檢驗項目質量控制涵蓋多個方面，包括分析前、分析中、分析后的各個層面，因此對技術人員、儀器、標本、環境要求更加嚴格。目前我國對分子診斷學技術人員的培訓尚不到位，技術人員在實驗操作、結果報告、臨床咨詢方面尚有很多不足之處。隨著人們對人類基因組功能研究的深入，人們對生命、疾病、衰老、死亡的認識更深。分子診斷涉及個體的基因差異，要求相關技術人員能夠提出專業的意見，指導預防疾病、降低患病風險，以及實現個性化治療等，這就對從事分子診斷學技術的工作人員的水平和素質提出更高的要求。

4前景和展望

在國際上，越來越多的分子診斷學技術應用于檢驗醫學，國內檢驗醫學界也越來越重視和發展分子診斷技術，并取得一定的成績。但是，無論是分子診斷學技術在檢驗醫學中的應用平臺，還是從事分子診斷技術人員的能力，以及相關的管理規范，與國外先進技術或管理比較，都處在落后的局面。希望通過檢驗醫學界同仁共同努力，規范管理分子診斷的開展，引進和培訓分子診斷技術人員，縮短與國外先進水平的差距，為疾病的診斷、療效檢測和預后判斷，作出高質量的分子診斷檢測。

作者：方炳雄翁錫泉巴艷紅秦澤鴻單位：普寧市人民醫院檢驗科