航空微重力生物學探析范文

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作者：楊肖孫聯文樊瑜波單位：北京航空航天大學生物與醫學工程學院生物力學與力生物學教育部重點實驗室

骨組織中的骨細胞是體內負責感應力學負荷的主要細胞，對機械應力的變化要比骨組織中其它細胞(如成骨細胞)更為敏感。正常重力環境下，當機械力作用于骨時會產生骨應變，引起骨基質變形并擠壓骨陷窩，骨細胞可直接感受骨應變產生的液體流動并間接受骨基質的擠壓作用，進而激活力學傳導通路，將力學刺激轉換為生化信號傳遞給成骨細胞和破骨細胞，使其做出相應反應，通過調控骨形成和骨吸收以調節骨的力學適應性。關于骨細胞力生物學方面研究的文獻報道始于20世紀90年代。早期研究一般使用的是原代培養的骨細胞，由于原代培養骨細胞的技術比較難，所以對骨細胞的研究十分有限。直到1999年Linda等從小鼠長骨分離出骨細胞，建立起骨樣細胞系MLO-Y4，此后骨細胞力生物學方面的研究才逐漸增多。然而，微重力和超重力環境下有關骨細胞對力學刺激的生物學響應方面的研究仍十分有限。本文主要綜述了正常重力下骨細胞對力學刺激下的生物學響應，以及骨細胞加載力學刺激后對成骨細胞和破骨細胞的調控作用，同時對微重力和超重環境下骨細胞力生物學方面的研究進展也作了回顧和總結。

1正常重力對骨細胞的作用

1．1骨細胞對力學刺激的響應

體外培養骨細胞并施加力學刺激，可產生一系列基因和分子代謝水平變化。骨細胞在力學刺激下，一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)、三磷酸腺苷(ATP)等信號分子釋放量顯著增多，Ca2+通道打開、胞外Ca2+涌入胞內，胰島素樣生長因子(IGF)-1、前列環素(PGI)-2等細胞因子改變，基因cox-2、c-fos表達升高，I型膠原、骨鈣素(BGP)、骨橋蛋白(OPN)等蛋白表達升高，Wnt/β-catenin信號通路和cAMP/PKA通路在力學刺激下分別被激活，Wnt家族Wnt3a，Con-nexin43，CD44等基因上調，Bcl-2/Bax的基因表達上調，表征凋亡的caspase3/7基因表達下調，糖皮質激素和腫瘤壞死因子(TNF)-α對骨細胞的凋亡作用被抑制，進而抑制骨細胞凋亡。

骨細胞對同一力學刺激下的響應隨加載時間和載荷大小而變化，響應敏感程度隨細胞不同形態或胞體不同區域而變化。Chen等研究表明，循環壓應力作用時間增加，某些基因的表達在作用時間變化的同時發生改變，導致骨細胞上調基因數減少，而下調基因數增多，致使骨細胞募集破骨細胞并發出活化信號的能力增強。Nesbitt等研究表明，骨細胞系受拉伸作用后細胞骨架F-actin排列發生解聚，這種解聚的發生隨加載循環的次數、頻率以及循環間歇刺激次數的增加而加倍，去負荷后重又回到原始水平。Ratha等發現，MLO-Y4受流體剪切力作用后其胞內鈣及NO濃度發生改變，且胞內鈣濃度隨剪切應力的增加而呈線性增加。Bacabac等發現，半懸浮或懸浮呈球形的骨細胞受力后短時NO釋放量增加幅度遠高于完全貼壁伸展的骨細胞，且半懸浮或完全懸浮骨細胞受微壓力后彈性常數和硬度小于貼壁骨細胞;Vatsa等［20］發現顱骨處骨細胞呈相對球形，腓骨處骨細胞呈細長形，分別對其進行測量后證實，顱骨處球形骨細胞各向異性小于腓骨處細長形骨細胞，兩項研究均提示呈球形的骨細胞對力學刺激更為敏感。另外，骨細胞細胞核區域的彈性模量遠小于細胞外周，提示核區域對力學刺激更為敏感;而骨細胞突觸引起附近鈣的瞬變所需的形變遠小于細胞體引起鈣瞬變所需的形變，提示骨細胞突觸比骨細胞體對力學刺激更為敏感。骨細胞對不同方式的力學刺激的響應也不同。Ponik等對MLO-Y4分別施加脈動和單向剪切力，發現骨細胞受單向剪切力24h后F-actin呈現線性排布，而脈動剪切力作用24h后F-actin則伸展出多個突觸，其形態與骨細胞突觸的形態類似。Miyauchi等發現，循環拉應力下骨細胞的胞內鈣明顯增加，胞外鈣大量涌入胞內，IGF-1mRNA表達明顯升高。但Teruko和Kamioka等［23-24］的研究表明，骨細胞受剪切應力作用后并未產生胞內鈣的瞬時變化響應。Jiang等發現，MLO-Y4受恒定剪切應力刺激后，Cx43表達上調使得由Cx43組成的間隙連接被激活，進而誘導胞內PGE2的釋放。而Genetos等發現，MLO-Y4受脈動剪切應力作用后，雖然Cx43蛋白組成的間隙連接被激活，但并不直接誘導PGE2的釋放，而是誘導ATP的釋放增加。

常用的對骨細胞施力形式主要包括牽拉力、壓應力和剪切力，而近年有學者利用原子力顯微鏡、光鑷、顯微操作針等新興力加載方式對骨細胞施力，測量其形態及彈性模量、硬度、各向異性等力學參數的變化。例如Sugawara等用原子力顯微鏡測量出成骨細胞、類骨細胞及骨細胞3種細胞的彈性模量，發現從成骨細胞向骨細胞轉化的3個階段細胞的彈性模量成比例下降，且骨細胞黏著斑附近彈性模量遠低于成骨細胞相同區域的彈性模量，提示骨細胞受到力學刺激后更易變形，間接反映骨細胞對力學刺激更為敏感的特性。

1．2力學刺激下骨細胞對成骨和破骨細胞的調控作用

骨細胞在響應力學信號時釋放的PGE2，NO，ATP，可溶性破骨細胞分化因子(sRANKL)，護骨素(OPG)等均是調節成骨細胞和破骨細胞活動的潛在因素。骨可承受的生理應變范圍在1200～1900με，相應的骨細胞可承受的剪切應力作用范圍在0．6～3Pa(1Pa=10dyn/cm2)，低于體內正常應力范圍的力學刺激會誘導骨細胞釋放PGE2等保護破骨細胞的信號分子，使OPG-L/ODF的mRNA水平升高，募集破骨細胞到應力作用低的部位，促進破骨細胞分化及活性，并增強骨吸收。而體內正常受力范圍內的力學刺激下，骨細胞釋放的PGE2下降而NO釋放量增加，抑制sRANKL/OPG釋放，驅散破骨細胞或抑制破骨細胞形成，阻止骨吸收的發生，同時增強成骨細胞活性，促進成骨作用。力學刺激后的骨細胞通過與成骨細胞的間隙連接或釋放信號分子至培養基內，增強成骨細胞的活性。Taylor等研究表明，共培養骨細胞和成骨細胞時，對骨細胞施加4．4dyn/cm2的恒定低剪切應力1h，骨細胞會通過細胞間隙連接向成骨細胞釋放Ca2+，使成骨細胞的堿性磷酸酶(ALP)活性增強，而用受剪切骨細胞的培養基培養成骨細胞2h，成骨細胞的ALP活性未見顯著增強。然而，Peter等發現，用7dyn/cm2，5Hz的脈動剪切應力作用骨細胞1h后的培養基培養成骨細胞48h，ALP活性明顯升高。這可能與不同力學刺激方式及培養成骨細胞的時間長短有關。骨細胞受力學刺激后還可抑制破骨細胞形成及活性。You等發現，將受10dyn/cm2、1Hz的脈動剪切應力作用2h后的骨細胞與破骨前體細胞共培養7d，可抑制前體細胞向破骨細胞分化，此外骨細胞釋放于培養基內的sRANKL/OPG下調。Tan等收集了受7dyn/cm2，5Hz的脈動剪切力1h的骨細胞培養基，用于培養破骨細胞6d，顯著抑制了破骨細胞的形成，進而阻礙骨吸收的發生。Lau等則利用低幅(0．3×g)高頻(30～90Hz)振動作用于骨細胞1h后的培養基培養破骨前體細胞5d，同樣抑制破骨前體細胞向破骨細胞的分化，同時骨細胞內的RANKL/OPG基因下調。受力后的骨細胞功能蛋白的表達也會發生變化，從而影響成骨和破骨。sclerostin是骨細胞特異性蛋白，為Sost基因的產物，與DDK1同是影響骨形成的蛋白，sclerostin和DDK1均可通過抑制Wnt信號通路阻礙骨形成的發生;壓縮小鼠尺骨后發現Sost基因轉錄、sclerostin及DDK1蛋白表達均下降，提示Wnt/Lrp5信號通路可能被激活。另外，HB-GAM也是一種骨細胞特異性蛋白，在骨細胞受剪切應力作用時上調，其表達參與力學刺激引起的成骨作用，但可能與骨吸收作用無關。

2微重力對骨細胞的影響

空間飛行為骨細胞力生物學研究提供了真實的微重力環境。Bacabac等在空間飛行實驗中搭載原代培養的骨細胞，并在飛行過程中對其施加脈動剪切應力，發現相關地面實驗組骨細胞受兩次剪切應力刺激后NO釋放量顯著增加，但由于硬件原因并沒有獲得有效的空間實驗組數據。Rodionova等發現，空間飛行搭載的獼猴髂骨早期骨細胞內，合成膠原蛋白的粗面內質網數量明顯增多，成骨細胞具有成纖維細胞顯型，其周圍被膠原纖維包圍且未出現骨礦化，骨陷窩形成被抑制;成熟骨細胞內合成溶酶體的高爾基復合體數量及溶酶體數量明顯增加，骨細胞溶骨活性增強，骨陷窩內已礦化的骨基質吸收增強。空間飛行的研究費用昂貴，因而地面實驗中常用嚙齒動物尾吊去負荷模型和細胞回轉裝置模擬微重力來進行相關研究。Basso等發現大鼠尾吊2周后，骨細胞凋亡率明顯上升，破骨細胞數量增加，脛骨骨量降低;重負載后大鼠體內骨細胞數和骨量恢復到正常水平，誘導型一氧化氮合酶(iNOS)陽性表達的骨細胞較原有水平上升50%，提示重負載可促進骨細胞NO釋放量的增加，進而抑制骨細胞凋亡和破骨細胞形成。此外，Aguirre等證實，小鼠尾吊后皮質骨內骨細胞首先發生大量凋亡，進而募集破骨細胞，導致凋亡區域優先發生骨吸收。另一研究表明，小鼠尾吊后，脛骨骨細胞的Sost基因表達明顯增加，抑制了Wnt/β-catenin信號通路，影響骨細胞活性及成骨細胞功能，阻礙骨形成;而敲除Sost基因的小鼠尾吊后Wnt/β-catenin信號通路并未被抑制，可有效對抗后肢廢用性骨量丟失。孟芮等利用細胞回轉器初探骨細胞模擬微重力后其培養基對成骨細胞功能的影響，發現用條件培養基培養的成骨細胞在24h和48h時明顯增殖，但OPN，Runx2，BGP，ALP等成骨相關基因表達明顯下降。Tatsumi等培育了一種轉基因小鼠(Tg小鼠)，其骨細胞可特異表達白喉毒素(DT)受體，注射DT可消除體內70%～80%骨細胞，Tg小鼠與野生型小鼠(WT小鼠)相比，表現出骨老化、骨脆性增加、成骨功能紊亂、骨小梁微結構退化等現象。但尾吊注射DT的Tg小鼠7d卻未出現模擬微重力引起WT小鼠的骨丟失現象，提示小鼠對負荷消失的感知需通過骨細胞。然而，如果給Tg小鼠注射DT去除骨細胞的時間后移至恢復負載期，則尾吊引起的骨量丟失2周內即可回升至正常水平，提示破骨和成骨細胞對負載力學刺激的響應可能無需通過骨細胞。

3超重對骨細胞的影響

近年來，Qian等開始利用大梯度高磁場(LG-HMF)構建出的0G重力或2G超重力環境，研究骨細胞形態學和骨架的變化。他們發現骨細胞在0G和2G環境中，細胞形態、胞核尺寸、細胞骨架排布及黏著斑蛋白的分布和表達相較1G對照組均發生變化，且猜測細胞粘附相關的蛋白可能參與了骨細胞感知力學環境的改變。Di等還對進行過拋物線飛行實驗的骨細胞其形態、細胞骨架等進行分析。飛行實驗在上升過程時產生超重環境加速度達1．8G，持續20s，并在自由下落時產生微重力環境。拋物線飛行實驗發現骨細胞的面積和高度沒有顯著性變化、無細胞凋亡現象，但肌動蛋白在細胞邊緣聚合增強，微管被分解且中心消失，Cx43蛋白表達下降，提示微重力與超重力環境的轉換導致骨細胞細胞骨架發生改變，并抑制細胞的間隙連接。地面實驗模擬空間發射超重環境時，3G的超重環境即可使成骨瘤細胞分裂旺盛、增值迅速并堆疊生長。此外，成骨細胞粘附性發生改變，肌動蛋白纖維數量和厚度增加、粘著斑蛋白數量增加，纖維蛋白熒光強度下降，成骨細胞膠原合成增加，I型膠原CollA2的mRNA表達增加。成骨細胞增殖明顯，細胞分化被抑制，PGE2釋放量增加。初期成骨細胞對超重的響應相較已分化的成骨細胞敏感，其在10G時釋放的PGE2是在正常重力環境下釋放量的2．5倍，且釋放量隨超重加速度以及持續時間的增加而增加。2G的超重環境可促進骨髓間充質干細胞的增殖，細胞內微管及微絲聚合作用加強，胞內ALP，Cbfa1和CollA1基因表達升高，促進其向成骨細胞分化，成骨功能增強。還有研究表明30G的超重環境會導致破骨細胞的活性升高。此外，VanLoon等［53］利用原子力顯微鏡在超重環境下對成骨細胞施加微壓力，發現成骨細胞細胞高度下降，細胞形態和細胞骨架結構發生變化，粘彈性發生改變，以適應力學刺激的變化。

4結語

骨細胞不僅是骨組織內對力學負荷變化最為敏感的細胞，其本身不同區域對力學刺激的敏感性也不同;同時當力學負荷的形式或加載時間發生變化時，骨細胞對其的響應也隨之有所改變。目前有關骨細胞正常重力下對力學刺激的響應及其對骨組織內其他細胞調控的研究已有較多的報道。然而，關于微重力下骨細胞力生物學研究還十分有限，微重力環境下骨細胞對力學刺激的生物學響應以及對其它細胞的調控，尤其超重下骨細胞對力學刺激的生物學響應，都有待深入的研究。