單細(xì)胞分離檢驗(yàn)技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用范文

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生物體是由單個細(xì)胞構(gòu)成的，人體大約由不同組織的3.72×1013個細(xì)胞組成。微量混合DNA的檢驗(yàn)一直都是法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的難題。雖然通過計(jì)算的方法可以對混合DNA圖譜拆分解釋，但是對于復(fù)雜混合圖譜，比如一個成分占主要時次要成分的檢驗(yàn)，或者3人以上混合圖譜的解釋就非常困難。細(xì)胞分離是一種獲得單一個體DNA分型相對直接的方式，低至幾個細(xì)胞甚至單個細(xì)胞的單細(xì)胞檢驗(yàn)技術(shù)也是微量DNA檢驗(yàn)的有效途徑。以高通量為特點(diǎn)的第二代測序技術(shù)（nextgenerationsequencing,NGS），能夠?qū)资f條DNA同時測序，實(shí)現(xiàn)了快速、高效、低成本的測序。近幾年來，單細(xì)胞分離技術(shù)和二代測序技術(shù)結(jié)合而產(chǎn)生的單細(xì)胞測序（single-cellsequencing,SCS）技術(shù)將為法醫(yī)DNA檢驗(yàn)帶來全新的技術(shù)手段。

1單細(xì)胞分離

單細(xì)胞分離的方法很多，包括顯微操作技術(shù)（micromanipulation）、激光捕獲顯微切割技術(shù)（lasercapturemicrodissection,LCM）、微流控技術(shù)（microfluidicplatforms）等。目前在法醫(yī)DNA檢驗(yàn)中實(shí)際應(yīng)用的技術(shù)平臺有兩種，顯微操作技術(shù)和激光捕獲顯微切割技術(shù)。

1.1細(xì)胞染色由于在實(shí)際案件中獲得的細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)并不是實(shí)驗(yàn)室理想的形態(tài)，為了更好的識別細(xì)胞，在普通顯微鏡下觀察時需要對細(xì)胞進(jìn)行染色。對于上皮細(xì)胞，我們研究組嘗試了不同的染色方法，通過聯(lián)用顯微操作技術(shù)對龍膽紫濃度梯度及時間梯度染色進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，0.5μL龍膽紫染液（0.05g/mL）加入100μL細(xì)胞懸液，5min后胞核著色即已明顯，能有效提高顯微捕獲單細(xì)胞分離檢驗(yàn)技術(shù)的檢測效能，另外，染色時間不影響DNA結(jié)果分析[7]。對于精子細(xì)胞染色，DiMartino等通過對比核固紅與巴氏染色法，證實(shí)巴氏染色法不僅能清晰的觀察精子細(xì)胞，而且不影響下游PCR擴(kuò)增[8]。Sanders等通過大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蘇木素/伊紅染色法（H&E）染色后的精子細(xì)胞STR分型峰高下降幅度較小，不影響分型結(jié)果[9]。也可以用熒光原位雜交技術(shù)對精子細(xì)胞的性染色體進(jìn)行標(biāo)記。

1.2顯微操作技術(shù)顯微操作技術(shù)是在顯微鏡下通過微毛細(xì)管吸取單個細(xì)胞。典型的顯微控制系統(tǒng)包含一個倒置顯微鏡加上一個操縱桿操作，電動精密控制平臺。其優(yōu)點(diǎn)是操作容易進(jìn)行，通過顯微鏡直觀地分離單個細(xì)胞，成本低，主要用于較小細(xì)胞群體中的目標(biāo)細(xì)胞分離。該平臺適合對案件中上皮細(xì)胞進(jìn)行分離，3個口腔上皮細(xì)胞平行16次試驗(yàn)均可獲得完整分型，甚至低至一個細(xì)胞也可得到完整分型，該方法已成功應(yīng)用于一起強(qiáng)奸案的檢驗(yàn)。在該案件中，提取受害人皮膚上的唾液斑，通過在鏡下分離有核的口腔上皮細(xì)胞（來自于犯罪嫌疑人）和無核角化的上皮細(xì)胞或細(xì)胞碎片（來自于受害者皮膚），成功獲得嫌疑人的STR分型。在案件中常碰到的血煙頭檢材，由于血液量大，常規(guī)方法很難獲得煙頭上唾液來源個體的STR分型，即使用單細(xì)胞分離檢驗(yàn)時，也常常獲得混合STR分型。本課題組在顯微操作標(biāo)準(zhǔn)流程的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，將吸取的細(xì)胞先在TNE緩沖液中清洗幾次，以徹底去除血液細(xì)胞碎片和游離DNA，最終獲得完整唾液來源個體的DNA分型。也有報(bào)道將顯微操作分離的方法用于精子分離，但精子細(xì)胞體積非常小，直徑只有約6μm，毛細(xì)管吸取操作相對困難，下面介紹的激光捕獲顯微切割技術(shù)平臺更加適合精子細(xì)胞的分離操作。顯微操作法存在以下幾個方面的不足。第一，由于依賴手工操作，對實(shí)驗(yàn)員的經(jīng)驗(yàn)與操作能力要求較高，自動化程度較低，而且玻璃吸針脆性大，操作時易碎。第二，耗時較長，操作繁瑣。第三，對于涂片后的檢材，必須在液體環(huán)境下進(jìn)行操作，容易受蒸發(fā)的影響，檢材蒸干后，再補(bǔ)水時容易造成檢材的損失，甚至帶來污染。第四，對于案件中陳舊樣本，根據(jù)形態(tài)識別細(xì)胞容易出錯。

1.3激光捕獲顯微切割技術(shù)激光捕獲顯微切割技術(shù)是利用UV（320~400nm）激光切割并捕獲涂于覆膜玻片上的細(xì)胞。儀器設(shè)備較昂貴，自動化程度較顯微操作技術(shù)平臺高，是目前法醫(yī)學(xué)應(yīng)用最有效的單細(xì)胞分離方法，可用于上皮細(xì)胞、精子細(xì)胞、白細(xì)胞等不同類型的細(xì)胞分離。目前，該平臺應(yīng)用較多的是性侵案中差異裂解法無法消除女性成分干擾的精斑檢材，通過在顯微鏡下尋找并捕獲精子細(xì)胞以消除女性成分。由于精子細(xì)胞是單倍體，理論計(jì)算證明捕獲15~20個未降解的精子細(xì)胞，有很高的可能性獲得完整的STR分型，實(shí)驗(yàn)證明至少捕獲30個精子細(xì)胞可獲得完整的STR分型。也有學(xué)者應(yīng)用懸液熒光原位雜交（suspensionfluorescenceinsituhybridization，S-FISH）對性侵案樣本進(jìn)行標(biāo)記，通過這種方法可以明顯減少前處理操作步驟。對于多個精子貢獻(xiàn)者的混合精斑，差異裂解法不能將每個貢獻(xiàn)者完全分離。近年來，我們研究組在這方面有深入的研究。通過聯(lián)合使用激光捕獲顯微切割方法和低體積擴(kuò)增技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)以單個精子細(xì)胞DNA為模板，進(jìn)行Y-STR擴(kuò)增檢測，并成功獲得三人混合精斑中各個來源人的Y-STR分型。研究組進(jìn)一步使用熒光原位雜交技術(shù)標(biāo)記Y型精子，特異性挑選Y型精子，通過優(yōu)化組合Y-STR基因座與10個常染色體STR基因座（auto-STR），構(gòu)建全新的YA-STR復(fù)合系統(tǒng)。其中，Y-STR基因座用于區(qū)分不同個體，通過組合Y-STR相同的圖譜，實(shí)現(xiàn)個體的常染色體STR分型檢驗(yàn)。首次嘗試將該技術(shù)應(yīng)用于三人混合精斑的檢驗(yàn)，準(zhǔn)確地獲得了三個個體的STR分型。近年來，我們研究組還利用該平臺建立了男女混合血液樣本的分離檢驗(yàn)技術(shù)方法。該平臺在尋找細(xì)胞這一步驟時耗時耗力。有研究組開發(fā)了自動化的圖像識別軟件，通過分析圖像中的光強(qiáng)、顏色和形狀，可實(shí)現(xiàn)快速識別細(xì)胞，但是對不同種類細(xì)胞準(zhǔn)確快速的識別仍需要進(jìn)一步的研究。

1.4微流控技術(shù)最近興起的微流控技術(shù)平臺因其高通量、自動化、可有效防止污染而備受關(guān)注。微流控裝置封閉的操作空間可以有效地避免污染，微升至納升的操作體積可以保證較高的樣品濃度，同時減少試劑消耗，雖然目前還沒有在法醫(yī)學(xué)單細(xì)胞分離中實(shí)際應(yīng)用，但未來有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2單細(xì)胞裂解

分離得到單細(xì)胞后，需將細(xì)胞裂解獲得基因組DNA。傳統(tǒng)的法醫(yī)DNA檢測需要對基因組DNA進(jìn)行純化，而對于單細(xì)胞檢驗(yàn)，為了避免DNA的損失，常略去純化步驟，裂解后直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。因此，裂解步驟要保證不影響后續(xù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的順利進(jìn)行。目前主要使用蛋白酶裂解，常用蛋白酶K或Protease（德國QIAGEN公司），酶解后高溫使胞內(nèi)蛋白質(zhì)及蛋白酶K變性失活，利于基因組DNA的釋放和下游PCR反應(yīng)。對于精子細(xì)胞可加入DTT，打斷二硫鍵，使細(xì)胞充分裂解。

3PCR擴(kuò)增

一個細(xì)胞中的總DNA量僅有數(shù)匹克，常規(guī)的PCR管擴(kuò)增需要的細(xì)胞數(shù)目較多，我們的研究結(jié)果顯示至少20個口腔上皮細(xì)胞或60個精子細(xì)胞檢測到Identifiler®PCR試劑盒（美國ABI公司）中全部分型。最近幾年發(fā)展起來的微量化反應(yīng)，即芯片-低體積PCR擴(kuò)增（on-chiplowvolume-polymerasechainreaction，LV-PCR）系統(tǒng)[23,24]，在低至1.5μL的PCR體系中，DNA模板與引物和聚合酶結(jié)合的機(jī)會明顯提高，使微量細(xì)胞甚至單個細(xì)胞進(jìn)行DNA分型變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)，不僅檢測的靈敏度得到提高，而且檢驗(yàn)范圍也大大拓寬了。LV-PCR使用貝克曼公司的AG480FAmpliGridslide進(jìn)行擴(kuò)增，前期大量的研究都是使用該產(chǎn)品進(jìn)行，而且實(shí)驗(yàn)證明該產(chǎn)品靈敏度、準(zhǔn)確性可滿足法醫(yī)單細(xì)胞檢驗(yàn)的要求。另外一種最新的方法也值得關(guān)注，是在微液滴里進(jìn)行PCR擴(kuò)增。首先將單個細(xì)胞和熒光標(biāo)記引物結(jié)合的微珠隨機(jī)擴(kuò)散在1.5nL的油包裹的瓊脂微流液滴中，在大量微液滴內(nèi)進(jìn)行平行的PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，于PCR擴(kuò)增管內(nèi)進(jìn)行二次擴(kuò)增，常規(guī)毛細(xì)管電泳檢測，通過對大量單個細(xì)胞進(jìn)行平行9重STR檢測，獲得混合樣本各成分的STR分型。

4數(shù)據(jù)分析

單細(xì)胞檢驗(yàn)由于DNA模板量非常低，其缺帶、多帶等現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生，stutter峰較常規(guī)擴(kuò)增強(qiáng)，單細(xì)胞檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析和低拷貝DNA的分析方法類似，需平行擴(kuò)增，綜合多次結(jié)果獲得最終的STR分型。一般來說至少需獲得5次有效分型（獲得13個基因座以上的結(jié)果）[28]，重復(fù)3次及以上的位點(diǎn)才能確認(rèn)為有效位點(diǎn)。

5單細(xì)胞測序

在二代測序技術(shù)和全基因組擴(kuò)增技術(shù)（wholegenomeamplification,WGA）發(fā)展的基礎(chǔ)上，2011年，Navin等人首次發(fā)明了單細(xì)胞測序（single-cellsequencing,SCS）技術(shù)，測定了人體單個細(xì)胞的基因組DNA。單細(xì)胞測序的文章呈逐年遞增狀態(tài)，從2011～2014年，由5篇文章上升至近30篇，涉及生物學(xué)多個領(lǐng)域，發(fā)表于生物學(xué)頂級期刊上。2013年《，科學(xué)》雜志將單細(xì)胞測序列為年度領(lǐng)域榜首《，自然方法》雜志將單細(xì)胞測序列為2013年年度最重要的方法學(xué)進(jìn)展。

5.1全基因組擴(kuò)增技術(shù)由于單個細(xì)胞DNA含量有限，需進(jìn)行全基因組擴(kuò)增才能滿足二代測序的最低DNA量。目前，已有多種以單個基因組為模板的全基因擴(kuò)增技術(shù)，簡稱寡核苷酸引物PCR技術(shù)（degenerateoligonucleotideprimedPCR,DOP-PCR）和多重置換擴(kuò)增技術(shù)（multipledisplacementamplification,MDA）。其中DOP-PCR方法覆蓋率低，但可獲得準(zhǔn)確的拷貝數(shù)。MDA方法是在恒溫下利用具有強(qiáng)模板結(jié)合的phi29DNA聚合酶和六聚物進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)。Phi29DNA聚合酶具有3’→5’外切酶活性，并且具有特殊的多重置換和連續(xù)合成特性，產(chǎn)生的DN段較大，約為50~100kb，可以覆蓋基因組的90%以上，和DOP-PCR方法一樣也會產(chǎn)生不同區(qū)域擴(kuò)增不平衡性，MDA方法產(chǎn)生的不平衡性不具有重復(fù)性。2012年，首次報(bào)道了基于多次退火環(huán)狀循環(huán)的擴(kuò)增技術(shù)（multipleannealingandlooping-basedamplificationcycles,MALBAC），該方法結(jié)合MDA擴(kuò)增技術(shù)和PCR擴(kuò)增技術(shù)的優(yōu)勢，利用特殊設(shè)計(jì)的引物，巧妙地使擴(kuò)增子的結(jié)尾通過互補(bǔ)而成環(huán)，進(jìn)而在一定程度上防止了基因組DNA的指數(shù)性擴(kuò)增，明顯降低了擴(kuò)增偏倚性，并顯著提高覆蓋度，但是該方法使用Bst聚合酶，沒有校錯活性（proofreadingactivity）。現(xiàn)有的商業(yè)化試劑盒各項(xiàng)參數(shù)見表1。全基因組擴(kuò)增技術(shù)雖然仍然會有基因缺失等問題，但是相信隨著時間的推移和技術(shù)的進(jìn)步，擴(kuò)增的準(zhǔn)確性會逐步提高。

5.2二代測序技術(shù)對單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增后進(jìn)行二代測序。二代測序技術(shù)具有快速、高效、低成本的優(yōu)點(diǎn)。近兩年來的研究表明，二代測序結(jié)果的準(zhǔn)確性很高，與傳統(tǒng)的Sanger測序相當(dāng)。二代測序技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中應(yīng)用研究很多，目前已經(jīng)有兩種商業(yè)化的試劑盒，美國ThermoFisherScientific公司開發(fā)的基于SNP的theHID-IonAmpliSeqTMIdentityPanel和theHID-IonAmpliSeqTMAncestryPanel，主要通過SNP檢測進(jìn)行個體識別和祖先推斷；美國Illumina公司開發(fā)的ForenSeqTMDNASignaturePrepKit，在一個PCR反應(yīng)中可以同時擴(kuò)增27個常染色體STR，8個X-STR，25個Y-STR，95個個體識別SNPs，56個祖先信息標(biāo)記(ancestryinformativemarkers,AIMs)和24個顯性特征SNPs，更適合法醫(yī)學(xué)應(yīng)用。這兩個公司使用的測序技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)見表2。

6單細(xì)胞檢驗(yàn)展望

目前單細(xì)胞測序尚未應(yīng)用到法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，但是具有很好的應(yīng)用前景，是單細(xì)胞檢驗(yàn)未來發(fā)展的重要方向。單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增后，利用二代測序大量平行測序的特點(diǎn)，對幾百個甚至幾千個細(xì)胞進(jìn)行平行測序，相當(dāng)于對一個樣本進(jìn)行數(shù)百次檢測，通過重復(fù)測定可部分克服全基因組擴(kuò)增帶來的基因缺失的不足。再者，該技術(shù)可以檢測混合樣本中次要成分的STR分型或者三人及以上混合樣本，一次獲得不同個體的STR、SNP等多種遺傳標(biāo)記。目前，單細(xì)胞測序成本偏高，需進(jìn)一步研發(fā)多重單細(xì)胞DNA測序平臺，能夠以較低的成本平行檢測數(shù)百個細(xì)胞，另外，作為第三代測序技術(shù)的單分子實(shí)時測序可直接“讀取”DNA序列，也是未來發(fā)展方向之一。總之，微量混合生物樣本的檢驗(yàn)一直是制約DNA檢驗(yàn)技術(shù)發(fā)揮作用的瓶頸，傳統(tǒng)的單細(xì)胞檢驗(yàn)技術(shù)因其高靈敏度、可特異性挑選細(xì)胞的優(yōu)勢已經(jīng)應(yīng)用到實(shí)際案件中微量混合生物樣本的檢驗(yàn)，而單細(xì)胞測序技術(shù)結(jié)合了二代測序技術(shù)大規(guī)模平行檢測的特點(diǎn)，將為微量混合生物樣品檢驗(yàn)提供一種全新的技術(shù)手段。

作者：豐蕾 楊帆 李彩霞 徐珍 凃政 李萬水 胡蘭 單位：公安部物證鑒定中心 法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市公安局刑偵總隊(duì)