造血干細胞研究白血病治療論文范文

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1斑馬魚的造血系統(tǒng)

成年斑馬魚的主要造血器官是腎臟，胸腺和脾臟也具有一定的造血功能。斑馬魚的造血系統(tǒng)與人類造血系統(tǒng)在進化上高度保守，具有和人類造血系統(tǒng)類似的信號傳導通路，斑馬魚造血系統(tǒng)以紅系、髓系、淋系及巨核系為主。在定向造血中，參與斑馬魚造血調(diào)控的許多重要轉(zhuǎn)錄因子如runx1、scl、lmo2、pu．1、c／ebpα、gata1和gata2等也與哺乳類動物十分相似［7］。利用斑馬魚胚胎透明的特點，結合轉(zhuǎn)基因技術，通過造血基因啟動子控制下游的增強型綠熒光蛋白（Enhancedgreenfluorescentpro－tein，EGFP）在特定血液細胞中表達，可直觀地觀測相應細胞的生物學行為和基因表達譜。近年來，斑馬魚已用于各種細胞型的人類白血病研究。

2斑馬魚的白血病模型

2．1斑馬魚的T細胞白血病模型斑馬魚的基因組估計約包含30000個基因，大體上與人類基因組數(shù)目相同，且其中許多基因所具的功能皆與人類的相當類似，因此斑馬魚能象人類一樣患癌癥，雖然其遺傳背景相對簡單，但構建穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因品系卻不太容易。ThomasLook和他的團隊第一次采用轉(zhuǎn)基因的方法在魚類中成功構建白血病模型。Langenau等［11］提出了在斑馬魚中構建轉(zhuǎn)基因品系的新方法，構建了表達小鼠原癌基因Myc的品系，而且得到了T細胞的白血病模型。Myc基因與人類白血病和淋巴瘤（lymphoma）發(fā)生有關，但不是唯一參與作用的基因。Felsenfeld等［12］、Feitsma等［13］將Myc基因包含在Rag2的啟動子下，使此基因在淋巴細胞中特異性地表達，再將表達載體微注射到斑馬魚的胚胎中去，分別包含1個GFP基因和沒有GFP基因的標記。產(chǎn)生的斑馬魚中有5％～6％發(fā)生了腫瘤，這個比例與單獨注射GFP后得到的轉(zhuǎn)化效率大體類似，這說明被轉(zhuǎn)入了Myc基因的斑馬魚都產(chǎn)生了腫瘤。這些斑馬魚在鰓附近的胸腺中產(chǎn)生了腫瘤，淋巴母細胞也滲透到了其造血的位點———腎實質(zhì)中。表達譜的分析發(fā)現(xiàn)，在得到的腫瘤中T細胞基因中發(fā)生了特異性的表達。Taylor等［14］、Mione等［15］發(fā)現(xiàn)在腫瘤細胞中的zTcr－a基因發(fā)生了重排，這進一步說明了腫瘤的發(fā)生起源于胸腺，而且也說明其他的突變對白血病的表型也是需要的。Nicoli等、ChanJ等將這些白血病淋巴母細胞重新注射到斑馬魚的體內(nèi)檢測腫瘤細胞的可轉(zhuǎn)移性，他們發(fā)現(xiàn)7d后，淋巴母細胞很快地散布到了斑馬魚的體內(nèi)，甚至到胸腺中。斑馬魚產(chǎn)生腫瘤后會很快死亡，因此Langenau等用這些斑馬魚的精子與野生型斑馬魚進行雜交，發(fā)現(xiàn)其后代也在4～6周之內(nèi)發(fā)生白血病。藉此方式Kimmel等、Sullivan等標出了加速或延緩T細胞ALL的相關基因，并提供了更快速且直接的方式以測試對抗此疾病的藥物。

2．2斑馬魚的B細胞白血病模型由于TEL和AML1序列在脊椎動物之間高度保守，TELEtsdomain在硬骨魚和人之間的同源性為93％，AML1Runtdomain在斑馬魚和人之間的同源性高達99％，因此可以通過用斑馬魚這種模式動物來研究TEL－AML1融合所導致的白血病的發(fā)病機理。在前B細胞急性淋巴白血?。╬re－BALL）中，25％的病人由于染色體重組導致TEL－AML1發(fā)生融合。HatemE．等構建了斑馬魚的B細胞白血病模型，他們首先采用3種啟動子來表達TEL－AML1：XEFpromoter（所有血液系中都有表達）、ZBApromoter（所有血液系中都有表達）、RAG2promoter（只在BandT淋巴細胞系中表達），構建了含有TEL－AML1的轉(zhuǎn)基因斑馬魚。通過RT－PCR的方法確定了斑馬魚的穩(wěn)轉(zhuǎn)系。同時為了分析淋巴祖細胞形成淋巴細胞的潛力，對祖細胞進行了促細胞分裂劑誘導的B細胞克隆形成試驗。并且發(fā)現(xiàn)在5個XEF－TA、9個XEF－EGFP－TA、17個ZBA－EGFP－TA轉(zhuǎn)基因斑馬魚中，有6％的轉(zhuǎn)基因斑馬魚發(fā)生了淋巴細胞數(shù)量性肥大。淋巴細胞數(shù)量性肥大是白血病發(fā)生的指標之一，由此可確定TEL－AML1轉(zhuǎn)基因斑馬魚B細胞分化受阻。可見，對于TEL－AML1誘導的白血病的移植，可通過從XEF－TA斑馬魚骨髓中分離出白血病細胞，然后將這些細胞注射到野生型斑馬魚的方法來研究，效果是十分明顯的。TEL－AML1轉(zhuǎn)基因斑馬魚模仿了人類pre－BALL，從中可發(fā)現(xiàn)與白血病發(fā)生相關的分子途徑。TEL－AML1轉(zhuǎn)基因斑馬魚為尋找在急性成淋巴細胞白血病產(chǎn)生過程中扮演重要角色的基因，以及尋找治療白血病的靶標建立了堅實的基礎。

3斑馬魚白血病模型在臨床治療方面的價值

斑馬魚已成為良好的白血病研究模型，篩選影響腫瘤進程的特定疾病相關基因，如影響腫瘤的發(fā)生、細胞特異性、疾病進展速度和腫瘤轉(zhuǎn)移過程等的基因，尋找抑制腫瘤的相關機制，都能加深對血液腫瘤治療的認識。通過研究斑馬魚白血病模型，陳竺院士、劉廷析研究員等發(fā)現(xiàn)蛋白泛素化修飾這種重要的翻譯后蛋白修飾過程存在于造血過程中，并且起到了不可忽視的作用。研究表明，6個小泛素相關修飾因子（smallubiquitin－relatedmodifier）同源基因缺失會導致原始造血中間細胞群中髓系特異性標記物mpo的急劇增多和紅系骨髓源性祖細胞（myelo－erythroidprogenitorcells，MPCs）的特異性標記物gata1的減少。

Zon等［28］、Ekker等還發(fā)現(xiàn)1個SUMO－CCAAT結合蛋白α（SUMO－C／ebpα）對維系骨髓細胞和紅細胞之間的平衡起重要作用。這些研究結果表明了泛素化在早期系譜決定中的作用，從而揭示了脊椎動物原始造血過程中新分子機制。在針對特定血液腫瘤疾病基因如myc、RAS、TEL－AML1等治療藥物大規(guī)模的小分子化合物篩選中，在臨床造血干細胞移植（Hemato－poieticcelltransplantation，HCT）治療白血病上，斑馬魚也已成為良好的可示蹤模型，Traver等通過采用亞致死劑量的γ射線照射發(fā)病的轉(zhuǎn)myc基因的T淋巴細胞白血病斑馬魚，并將帶有熒光的野生型斑馬魚的腎臟造血干細胞移植入這些魚體內(nèi)，實時觀測到整個造血重建的過程，可看到白血病發(fā)病魚的淋巴組織由移植的造血細胞重建，這在很大程度上模擬了人類骨髓移植治療白血病的過程。

法國科學家日前通過對斑馬魚胚胎進行實時監(jiān)控，發(fā)現(xiàn)了其造血干細胞的生成機理。Thermes等、Craven等采用即時成像技術對斑馬魚的胚胎進行了觀察，結果發(fā)現(xiàn)，斑馬魚胚胎主動脈的部分內(nèi)皮細胞先是發(fā)生卷曲，隨后蜷縮成一團，最后從主動脈的內(nèi)壁脫落，形成可以流動的干細胞，而主動脈的內(nèi)壁依然保持完好。此后，新形成的干細胞再發(fā)生分裂，轉(zhuǎn)變?yōu)樵煅杉毎Ｈ绻蓄愃频臋C制存在于人體，醫(yī)生只要提取病人血管的細胞，將其培育成造血干細胞后再移回人體，就有可能幫助病人重建造血系統(tǒng)。

4結語

隨著更多疾病模型的建立，良好的穩(wěn)轉(zhuǎn)體能幫助人們更加全面準確地解釋基因功能。對于未知基因的功能和人類疾病的動物模型，作為模式生物的斑馬魚在未來研究中也將會有誘人的應用前景。此外，利用斑馬魚進行活體高通量藥物篩選也將為白血病患者提供更加深切的關懷。同時基于斑馬魚白血病模型的活體可示蹤造血干細胞移植研究也將為白血病的治療發(fā)展提供前所未有的動力，對進一步提升人類整體健康水平作出貢獻。

作者：張國良李軍單位：湖北省荊州市中心醫(yī)院檢驗科