流產組織物的遺傳學分析范文

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摘要:

目的分析胚胎絨毛染色體異常情況與復發性流產之間的臨床關系。方法選擇2012年2月－2014年2月于河北省人民醫院優生優育優教中心和婦產科門診擬行流產的孕12周內孕婦共149例，分為4組，即正常組30例，病例1組36例，病例2組40例，病例3組43例。應用絨毛染色體細胞培養G顯帶分析技術、熒光原位雜交技術(FISH)、高通量全基因組DNA測序技術等3種方法對絨毛細胞進行染色體檢查。結果149例樣本中共有55例染色體異常核型，異常核型中三體綜合征占65.45%，以5－三體、16－三體、22－三體多見，Turner綜合征占12.73%，結構異常占10.91%;正常組染色體異常率明顯低于其他3組，差異有統計學意義(χ2值分別為14.46、22.32和8.25，P＜0.01)。病例1組和病例2組染色體異常率差異無統計學意義(χ2=1.29，P＞0.05)。病例1組和病例2組染色體異常率明顯高于病例3組，差異有統計學意義(χ2值分別為2.7、6.27，P＜0.05);發生2次自然流產的胚胎染色體異常率最高，隨著自然流產次數增加，胚胎染色體異常率反而呈下降趨勢。結論該研究通過絨毛染色體細胞培養G顯帶分析技術、FISH、高通量全基因組DNA測序技術等對比研究，建立了一套臨床醫生如何科學地選擇絨毛染色體檢測方法的標準，有效指導臨床。

關鍵詞:

復發性流產;染色體分析;熒光原位雜交技術;高通量全基因組DNA測序技術

自然流產是患病率呈逐年上升趨勢的婦產科常見疾病，占臨床確診妊娠的15%～20%。自然流產的病因復雜多樣，以胚胎染色體異常為主要病因。因此，本研究選用絨毛染色體細胞培養G顯帶分析技術、熒光原位雜交技術(FISH)、高通量全基因組DNA測序技術等3種方法對絨毛細胞進行染色體檢查，不僅可以對自然流產的病因做出遺傳學的判斷，還可以為臨床婦產科工作者提供如何選用合適的絨毛染色體檢測方法提供可靠的指導。

1資料與方法

1.1研究對象選擇2012年2月－2014年2月于河北省人民醫院優生優育優教中心和婦產科門診擬行流產的孕12周內孕婦共149例，年齡20～35歲，平均(29.3±0.4)歲。研究對象分為4組:正常妊娠且無流產史擬行人工流產術的孕婦30例(正常組);第1次發生胚胎停止發育的孕婦36例(病例1組);2次胚胎停止發育或自然流產史的孕婦40例(病例2組);3次或3次以上胚胎停止發育或自然流產史的孕婦43例(病例3組)。

1.2絨毛染色體的檢測方法常規絨毛組織制片、G顯帶、顯微鏡下染色體核型分析。1.3絨毛組織的熒光原位雜交具體步驟按試劑盒 說明進行標本預固定、變性雜交。由北京金菩嘉醫療科技有限公司提供FISH試劑盒，包括GLP13/GLP21(定位于13q14/21q22)、GLP16/GLP22(定位于16q22/22q11.2)、CSP18/CSPX/CSPY。熒光信號判斷:Olympus熒光顯微鏡下觀察，對于正常的絨毛細胞、GLP13(綠色)/GLP21(紅色)及GLP16(紅色)/GLP22(綠色)探針組雜交后可檢測到2個綠色和2個紅色信號;CSP18(天藍色)/CSPX(綠色)/CSPY(紅色)探針組可檢測到2個天藍色、1個綠色和1個紅色信號(男性)，或2個天藍色、2個綠色信號(女性)。

1.4流產組織染色體異常的高通量全基因組DNA測序技術檢測樣品準備及DNA提取:取流產的胎兒絨毛組織100mg，用PBS清洗，通過QiagenQIAampDNAMini試劑盒提取全基因組DNA，并對提取的樣品進行質控檢測;文庫構建打斷:采用Covaris打斷法，將樣品DNA打碎至250bp大小的片段;末端修復:使用T4DNAPolymerase、KlenowDNAPolymer-ase和T4PolynucleotideKinase將打斷形成的黏性末端修復成平末端;末端加“A”:通過3＇端加堿基“A”，使得DN段能與3＇端帶有“T”堿基的特殊接頭連接，過程中用磁珠法選擇需回收的目的片段產物;聚合酶鏈式反應(PCR):使用PCR技術(10個循壞)擴增兩端帶有接頭的DN段;上述步驟反應后的DNA使用PCRPurificationSystem60mlkit回收，用等體積的AmpureBeads進行純化;Pooling構建好的文庫經Agilent2100Bioanalyzer及實時定量基因擴增熒光檢測系統(QPCR)檢測合格后，將一定量的文庫按照等物質的量混合;上機測序(Hiseq2000)后進行信息分析。

2結果

2.1絨毛染色體細胞培養G顯帶分析技術檢測結果本研究共納入149例研究對象，其中正常組30例，病例1組36例，病例2組40例，病例3組43例。正常組30例均為新鮮有活力絨毛，故全部采納絨毛染色體細胞培養G顯帶分析技術檢測，培養成功率100%。其中僅1例為21－三體(3.33%);其余全部為正常核型(96.67%);其余3組均為胚胎停止發育患者，大部分絨毛組織不新鮮，采用絨毛染色體細胞培養G顯帶分析技術+FISH檢測方法，或直接采用流產組織染色體異常的高通量全基因組DNA測序技術檢測，以確保檢測成功率達100%。共48例進行絨毛染色體細胞培養G顯帶分析技術檢測，培養成功43例(89.58%)，失敗5例(10.42%)。失敗標本中，1例因細胞不貼壁生長，4例未見分裂象;貼壁細胞生長，單細胞狀態差，絨毛組織已老化。成功進行染色體核型分析的患者中，核型正常18例(41.86%)，核型異常25例(58.14%);未成功的5例均加做FISH檢測。

2.2絨毛組織細胞的FISH檢測結果選取了9例進行絨毛染色體細胞培養G顯帶分析技術+FISH檢測。9例絨毛中均顯示了FISH檢測信號，檢測成功率為100%。6例絨毛組織中，應用3組FISH探針檢測信號與正常組相同，未檢測出異常信號。還有3例絨毛組織中檢測到了FISH異常信號，包括1例三倍體;1例顯示21號染色體均有3個雜交信號，2個X信號;1例18號染色體3個雜交信號，1個X信號，1個Y信號。

2.3流產組織染色體異常的高通量全基因組DNA測序技術檢測結果選取了65例病例組絨毛組織進行絨毛組織高通量全基因組DNA測序技術檢測，檢測成功率達100%。其中26例異常:16－三體6例;5－三體5例;22－三體5例;21－三體1例;13－三體3例;4－三體2例;6－三體1例;45，X03例。

2.4綜合絨毛染色體細胞培養G顯帶分析技術、FISH、高通量全基因組DNA測序技術檢測結果綜合3種方法發現149例樣本中共有55例染色體異常核型，異常核型中三體綜合征占65.45%，以5－三體、16－三體、22－三體多見，Turner綜合征占12.73%，結構異常占10.91%。4組染色體情況顯示，正常組30例中僅1例為13－三體，染色體異常率為3.33%;病例1組染色體異常率44.44%;病例2組染色體異常率57.50%;病例3組染色體異常率34.88%。正常組染色體異常率明顯低于其他3組，差異有統計學意義(χ2=14.46、22.32、8.25，P＜0.01);病例1組和病例2組染色體異常率差異無統計學意義(χ2=1.29，P＞0.05);病例1組和病例2組染色體異常率明顯高于病例3組，差異有統計學意義(χ2=2.7、6.27，P＜0.05)。

3討論

妊娠早期的自然流產現已上升為臨床婦產科工作中遇到的最常見的疾病之一，患病率逐年上升且病因復雜。胚胎染色體異常為誘發自然流產的一個主要原因［1］，同時為出生缺陷的主要危險因素。絨毛細胞和胚胎組織的遺傳信息相同，它由受精卵有絲分裂產生，故可以作為檢查胚胎染色體的標本［2］。絨毛細胞染色體檢查能夠幫助臨床醫生了解胚胎染色體的情況，查找出自然流產的病因，為診療工作提供依據。目前檢查絨毛染色體的方法常用以下5種:絨毛染色體細胞培養G顯帶分析技術、FISH、熒光定量PCR(QF－PCR)、高通量全基因組DNA測序技術、微陣列比較基因組雜交技術(Array－CGH)。1983年Simoni等［3］采用直接法首次成功制備了人工流產絨毛染色體，1986年Hansmann等［4］將其用于自然流產的檢查取得了良好的效果，之后逐漸廣泛應用至今，成為傳統的細胞遺傳學方法，可以準確檢出自然流產物或胎兒染色體結構和數目的異常，是檢測自然流產組織染色體核型異常或產前診斷的金標準。該方法技術穩定、質量可靠，能提供染色體改變的完整圖，其費用低，臨床應用廣泛。同樣，該技術需要進行細胞培養，耗時長，微小的染色體畸變(＜5Mb)不易檢出，成功率直接受制于絨毛組織的新鮮程度和絨毛的形態［5］。胚胎停止發育時，絨毛生長受到影響，停止發育時間越長，組織越不新鮮，形態就越差，細胞培養成功率就越低。本研究中正常組絨毛組織全部為新鮮絨毛組織，30例標本絨毛染色體培養全部成功，而其他3組的絨毛標本，選擇外觀相對新鮮，形態較好的絨毛標本進行細胞培養G顯帶分析48例，培養成功43例，成功率達89.58%。

FISH利用熒光標記的DNA探針與被檢測樣本中DNA堿基對的互補性，在探針與樣本DNA雜交后，通過熒光顯微鏡檢測熒光信號發現細胞、組織樣本中的染色體或基因異常。可以檢測細胞間期的染色體，不需要細胞培養，在48h內得到結果，明顯減輕患者等待結果過程的焦慮情緒。結果判讀簡單，精確度高，靈敏性好，特異性強，可檢測平衡易位，準確檢測3Mb大小的結構異常，用于羊水間期細胞產前診斷非整倍體的檢測與核型分析的準確率幾乎一致［6］。本研究選取了13/21、16/22、18/X/Y3組探針對9例相對不太新鮮，形態稍差絨毛組織進行細胞培養G顯帶分析技術和FISH檢測。其中5例細胞培養G顯帶分析技術檢測失敗，其余4例與FISH檢測結果一致，9例FISH檢測全部成功。3例絨毛組織中檢測到了FISH異常信號，分別為三倍體、21－三體、18－三體。高通量全基因組DNA測序技術以能1次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定等為標志。不需要培養，操作簡單，分析周期短，特異性強，分辨率高，覆蓋整個基因組，最小可以檢測到10Kb的微小片段異常。目前應用較多的是目標基因組區域測序，絨毛樣本染色體檢測方面，僅用于染色體非整倍體的快速檢測。目前進行全基因組染色體檢測報道較少。它費用較高，并且不能發現染色體平衡易位、倒位或點突變及染色體整倍體。因此，還不適合作為常規檢測方法，但可作為常規染色體核型分析的補充檢測手段［7－8］。本研究選取了65例胚胎停止發育時間長，絨毛組織陳舊、形態極差樣本進行高通量全基因組DNA測序技術檢測染色體，檢測成功率達100%，發現26例異常。綜合以上，不難發現，臨床醫務工作者對于流產患者，首選絨毛染色體細胞培養G顯帶分析技術;其他技術如FISH、高通量全基因組DNA測序技術等可以作為絨毛染色體細胞培養G顯帶分析技術的補充和完善。所以，應根據胚胎停止發育時間、絨毛組織新鮮程度、患者流產次數和經濟狀況、對胚胎停止發育流產原因追查的迫切情況等幫助患者分析，選擇合適的染色體檢測方法。

本研究采用3種絨毛染色體檢測技術發現149例樣本中共有55例染色體異常核型，異常核型中三體綜合征占65.45%，以5－三體、16－三體、22－三體多見，Turner綜合征占12.73%，結構異常占10.91%。與文獻報道的通過多種方法檢測自然流產絨毛組織染色體發現50%～70%存在核型異常，而結構異常比較少見，僅占6%基本一致［9］，明顯低于86%的異常率［10］?，F已證實染色體數目異常發生的主要原因是在發生減數分裂的配子中或早期卵裂的受精卵中出現了染色體異常的分離和復制［11］。從4組染色體情況來看，正常發育胚胎染色體異常率很低;發生1次自然流產和2次自然流產的染色體異常率沒有明顯差別，約44.44%～57.50%;而3次或3次以上復發性流產的染色體異常率反而較1次或2次流產的低，提示隨著流產次數的增加，存在著更多其他方面導致流產的原因。

作者：李亞麗 余小平 王方娜 高健 楚偉 李娟 霍平 王超 單位：河北省人民醫院