右哌甲酯貼劑體外透皮特性的考察范文

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《中國醫藥工業雜志》2016年第四期

摘要：

建立了HPLC法測定體外透皮接收液中的右哌甲酯濃度。分別考察了右哌甲酯在不同pH值介質中的穩定性和飽和溶解度。結果表明，以pH4.5磷酸鹽緩沖液為接收介質時，右哌甲酯在48h內僅降解0.17％，且滿足漏槽條件。進一步考察了不同種屬皮膚和不同種類促透劑對貼劑中右哌甲酯體外透皮特性的影響。結果表明，使用大鼠和裸鼠皮膚為屏障時，9h已有70％的藥物透過，因此選用最難透過的巴馬香豬皮膚；1,3-丙二醇、油酸、月桂氮酮、聚乙二醇400和N-甲基吡咯烷酮在5％濃度下均能略增強右哌甲酯的滲透性，但均無顯著差異(P>0.05)，而薄荷醇呈現出阻礙右哌甲酯滲透的作用。

關鍵詞：

右哌甲酯；透皮貼劑；體外透皮；促透劑

鹽酸哌甲酯(methyphenidatehydrochlide)是治療兒童注意力缺陷和多動障礙(attention-deficit/hyperactivitydisder，ADHD)的臨床一線用藥，通過阻斷突觸前神經元對去甲腎上腺素和多巴胺的再攝取，增加ADHD相關腦區的單胺類物質含量而發揮作用[1]。鹽酸哌甲酯普通片劑半衰期僅2～3h，每日需多次給藥[2]。為提高患者順應性，鹽酸哌甲酯緩控釋膠囊(OS®MPH，美國Alza公司)和哌甲酯貼劑(Daytrana®，美國NovenTherapeutics公司)相繼上市，每日僅需給藥1次。近年來研究表明，其右旋體為藥理活性物質，且隨手性分離技術的進步，鹽酸右哌甲酯緩控釋膠囊(Focalin®XR，美國NovartisPharmaceuticals公司)亦獲得FDA上市批準。Daytrana®采用經皮給藥的途徑，便于吞咽困難的口服患者使用；發生不良反應時易于移除；可防止該中樞神經系統興奮藥的濫用[1,3,4]。Focalin®XR可減少給藥量，同時避免左旋體的潛在危害[4]。因此，開發右哌甲酯(demethyphenidate，1)貼劑可綜合以上兩產品的優勢，為ADHD治療提供更優良的制劑產品。本研究采用HPLC法測定1透皮貼劑的透皮吸收量，方法簡便、快速、準確。此外，篩選了接收介質、體外皮膚模型和常用促透劑，為后期制劑的研發提供幫助。

1儀器與試藥

LC-20A型高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司，包括LC-20AD型溶劑輸送泵、SPD-20A型紫外-可見檢測器、SIL-20AC型自動進樣器和LCsolution色譜工作站等)；TK-20A型透皮擴散試驗儀(立式Franz擴散池，上海鍇凱科技貿易有限公司)。1堿基原料藥(含量98.0％，批號XLX20150421)和1鹽酸鹽對照品(純度99.80％，光學純度100％，批號XLX130508)(上海醫藥工業研究院)；溶劑型丙烯酸酯壓敏膠DURO-TAK®(德國Henkel投資有限公司)；薇婷脫毛膏(英國利潔時集團)；N-甲基吡咯烷酮(NMP，國際特品香港有限公司)；月桂氮酮(azone，天門科捷制藥有限公司)；1,3-丙二醇(PG)、聚乙二醇(PEG)400和分析純的磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、磷酸、三乙胺(國藥集團化學試劑有限公司)；薄荷醇(上海新華香醫料工貿有限公司)；油酸(OA，清明化工廠)；甲醇為色譜純，水為純凈水，其他試劑為分析純。雌性SD大鼠[(220±10)g，上海市西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號SCXK(滬)2008-0016]；裸鼠[(20±2)g，雌雄不限，上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號SCXK(滬)2007-0005]；雌性巴馬小香豬[(7±0.3)kg，上海甲干生物科技有限公司，許可證號SCXK(滬)2010-0028]。

2方法與結果

2.1離體皮膚的制備在SD大鼠背部確定脫毛區域。先將受試動物固定好，剪短脫毛部位毛發，然后均勻涂抹脫毛膏。3～5min后用溫水將脫毛部位的皮膚擦洗干凈，毛巾擦干。脫毛后觀察12h。皮膚發紅、破損、脫毛不完全的個體剔除。大鼠頸椎脫臼處死，取下背部皮膚，小心除去皮下脂肪組織和黏連物，用生理鹽水沖洗干凈，無紡布吸干皮膚表面水分，選擇皮膚完整的部位于-20℃保存備用。取健康裸鼠頸椎脫臼處死，立即剝離背部皮膚，小心除去皮下脂肪組織和黏連物，用生理鹽水沖洗干凈，無紡布吸干皮膚表面水分，選擇皮膚完整的部位于-20℃保存備用。取健康2月齡巴馬小香豬處死，剔除毛發后，分離背部皮膚并小心除去皮下組織，用生理鹽水沖洗干凈，無紡布吸干皮膚表面水分，選擇皮膚完整的部位于-20℃保存備用。

2.2貼劑的制備精密稱取1堿基原料藥0.44g，加入無水乙醇適量，超聲5min使藥物全部溶解，再精密稱取丙烯酸壓敏膠4.8g，攪拌10min，至體系混合均勻。直接均勻涂布干燥后得對照組貼劑40貼；加入各種促透劑，繼續攪拌5min后均勻涂布干燥后制得含促滲劑組貼劑。同比例無水乙醇與丙烯酸壓敏膠混合均勻后，直接涂布得空白貼劑。

2.3體外分析方法的建立

2.3.1對照品貯備液配制精密稱取1鹽酸鹽對照品13.10mg(相當于1堿基11.33mg)，置10ml量瓶中，用少量甲醇溶解后，加甲醇定容，搖勻，配制成濃度為1310g/ml的1鹽酸鹽對照品貯備液，置4℃冰箱中避光保存。臨用前恢復至室溫，再用甲醇稀釋至所需濃度。

2.3.2體外透皮試驗及樣品處理采用透皮擴散儀進行試驗，水浴溫度32℃，攪拌轉速300r/min，透皮面積3.14cm2，接收池體積7ml，以0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH4.5)為接收介質。將貼劑貼于皮膚角質層面，確保緊密接觸無氣泡后固定于擴散池。于規定時間取樣0.3ml，補加同溫同體積新鮮接收液并排除接收室中氣泡。接收液置0.5mlEP管中，離心(12000×g)3min，取上清液，進樣分析。

2.3.3色譜條件色譜柱InertsilODS-SP柱(4.6mm×250mm，5m)；流動相甲醇∶1.828g/ml磷酸二氫鉀水溶液∶磷酸∶三乙胺(300∶700∶2.1∶4.2)；檢測波長210nm；流速1.0ml/min；柱溫40℃；進樣量20l。

2.3.4專屬性試驗取空白接收液、對照品溶液、貼劑體外透皮樣品，按“2.3.3”項下條件進樣分析。結果表明，1的保留時間為15.8min，皮膚中內源性物質不干擾樣品測定。

2.3.5線性試驗及定量限精密量取1鹽酸鹽對照品貯備液適量，用空白接收液逐級稀釋，配制成1堿基濃度分別為0.23、0.57、1.13、5.67、11.33、22.66、56.65和113.3g/ml的對照品溶液。按“2.3.2”項下方法處理后進樣分析，以峰面積(Y)為縱坐標，濃度(c)為橫坐標線性回歸，得回歸方程為Y=36595.9453c-6032.9449，r=1.0000。表明1堿基在0.23～113.3g/ml濃度范圍內線性關系良好。本法定量限(LOQ)為0.1133g/ml(S/N≥10)。

2.3.6精密度試驗以空白接收液配制含1堿基濃度分別1.13、22.66和113.3g/ml的對照品溶液，各5份，按“2.3.2”項下方法處理，同1d內不同時間測定；于1周內不同時間同法測定。計算得樣品的日內及日間RSD分別為1.49％(n=9)和1.68％(n=9)，表明方法精密度良好。

2.3.7回收率試驗取“2.3.6”項下高、中、低濃度樣品，各5份，經0.45m微孔濾膜過濾，按“2.3.2”項下方法處理后進樣測定。由標準曲線計算濃度。計算得樣品平均回收率為98.40％，RSD為0.28％(n=15)，符合測定要求。2.3.8穩定性試驗將接收液樣品分別于室溫和4℃下存放，分別于0、2、4、24和48h時進樣測定，記錄色譜圖。計算得樣品峰面積的RSD為0.75％和0.46％(n=5)，表明接收液在樣品于室溫和4℃條件下48h內穩定。2.4接收介質的選擇2.4.11堿基在接收介質中的穩定性分別以水溶液及pH4.5、5.0、5.5、5.8、6.5和6.8的PBS為溶劑，配制1堿基濃度為100g/ml的溶液，置32℃水浴中，于0、0.5、1、2、4、6、8、24和48h時取出，按“2.3.3”項下條件測定濃度，考察1堿基在不同溶液中的穩定性。結果(表1)表明，1堿基隨著pH值升高，穩定性下降，在pH4.5時穩定性最好，48h內僅有0.17％降解，滿足分析要求，選擇此溶液為接收介質。

2.4.21堿基在接收介質中的飽和溶解度取過量的1堿基原料藥置具塞試管中，分別加入適量pH4.5、5.0、5.5、5.8、6.5和6.8的PBS及蒸餾水，于32℃水浴振搖48h后取樣，經0.45m微孔濾膜過濾，以甲醇稀釋后按“2.3.3”項下條件測定，計算得1堿基在不同溶媒中的平衡溶解度分別為(40.12±0.37)、(34.65±0.94)、(28.78±0.14)、(11.52±0.08)、(6.00±0.06)、(4.59±0.11)和(4.38±0.16)mg/ml(n=3)。可見，隨pH值降低，其飽和溶解度升高。已上市哌甲酯貼劑Daytrana®的哌甲酯含量為2.2mg/cm2，因右旋體為藥理活性物質，故本品中1含量暫設計為1.1mg/cm2，1堿基完全透過后，藥物濃度為0.49mg/ml，所以各接收介質均滿足漏槽條件。

2.5體外透皮模型選擇取對照組貼劑按“2.3.2”項下方法操作，分別于0.25、0.5、1、2、4、6、9和24h定時取樣。按“2.3.3”項下條件測定。4h后的樣品需稀釋10倍后分析。采用外標法計算單位面積累積透過量(Q)。以Q對時間t進行線性回歸(因本品擬設計為緩釋9h，所以采用前9h數據進行線性回歸)，所得方程的斜率即為藥物穩態透皮速率Js，同時計算滯后時間(tlag)及相關系數(r2)。考察了不同皮膚種屬對本品中1滲透性能的影響，結果見表2和圖2。結果表明，1滲透的難易順序為豬皮、大鼠皮、裸鼠皮。使用大鼠皮與裸鼠皮時，在9h已有超過70％的藥物透過皮膚，對處方優化的區分力度較差，所以選擇最難透過的豬皮作為體外試驗的皮膚屏障。

2.6促透劑篩選取對照貼劑和含5％不同種類促透劑(分別為月桂氮酮、NMP、薄荷醇、OA、PG和PEG400)貼劑(1.1mg/cm2)按“2.3.2”項下方法，分別于0.25、0.5、1、2、4、6、9和24h定時取樣處理。按“2.5”項下方法計算Js、tlag及增滲比(ER，計算公式見式①)。比較各促透劑對1的經皮促透效果，結果見表3和4。ER值結果表明，幾種促透劑在9h內的促透作用次序為：PG>OA>月桂氮酮≈PEG400>NMP>薄荷醇。其中，含薄荷醇的貼劑中1的累積滲透量相比對照貼劑有所降低，說明它在濃度5％時表現為阻礙1滲透的作用。但與對照貼劑組相比，各組Js值和ER值無顯著差異(P>0.05)，說明本試驗中各促透劑對1的滲透行為無顯著影響；除OA組外，tlag也均沒有明顯改變。

3討論

3.1哌甲酯含有酯鍵，在水溶液中易發生水解，主要生成降解產物哌甲酸。在體外透皮接收介質的篩選中，為模擬人體體液環境，不可避免地使用水溶液作為接收介質。目前未見關于哌甲酯堿基在水溶液中穩定性的報道，吳娟等在研究鹽酸哌甲酯緩釋微丸時，對鹽酸哌甲酯在各介質中的穩定性進行了考察，報道其在水，pH1.2鹽酸，pH4.0、6.5、6.8和7.5的PBS中24h內相對穩定，但隨pH值升高穩定性下降[5]。本研究表明，1堿基更不穩定，在pH值高于5.5后，24h內有明顯降解。

3.2裸鼠皮、大鼠皮和豬皮因易于獲得且與人體皮膚相似，經常用于透皮貼劑體外篩選，尤以豬皮與人體最為相近[6]。皮膚種屬比較結果表明，1堿基滲透的難易順序為豬皮、大鼠皮、裸鼠皮。1貼劑設計為9h給藥，而使用大鼠皮與裸鼠皮在9h已有超過70％的藥物透過皮膚，對于處方優化的區分力度較差，所以選擇最難透過的豬皮作為體外皮膚模型。裸鼠皮對1堿基的通透性是豬皮的3倍，與王鑫等對他克莫司體外經皮滲透性的考察結果一致[7]。

3.3考察了多種促透劑對1堿基透皮的促透作用，結果表明PG的促透效果最好，其次為OA和月桂氮酮。俞媛等對鹽酸哌甲酯透皮特性的研究表明，5％PG與3％月桂氮酮聯用的促透作用明顯(P<0.05)[8]。后期需要考察促透劑聯用對1堿基的促透效果。

作者：張成豪 羅華菲 林國鋇 武余波 王浩 單位：中國醫藥工業研究總院藥物制劑國家工程研究中心