雙醋瑞因有關物質的測定范文

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《中國醫藥工業雜志》2016年第四期

摘要：

建立了高效液相色譜法測定雙醋瑞因的9個有關物質。采用PhenomenexProdigy100AODS3色譜柱，以乙腈∶25mmol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調至pH2.2)(42∶58)為流動相，檢測波長254nm。雙醋瑞因及其有關物質(除七乙酰蘆薈苷)在0.2～3.0g/ml范圍內線性關系良好，七乙酰蘆薈苷在0.6～3.0g/ml濃度范圍內線性關系良好。有關物質的平均回收率96.8％～99.9％，RSD為1.7％～3.5％。

關鍵詞：

雙醋瑞因；有關物質；高效液相色譜；測定

雙醋瑞因(diacerein，1)，化學名為4,5-二乙酰氧基-9,10-二氫-9,10-二氧代-2-蒽羧酸，是白介素(IL)-1抑制劑，主要用于治療骨關節炎[1]。本品以蘆薈大黃素(3)為原料，經過酰化制得三乙酰蘆薈大黃素(6)，再經氧化制得。依據合成路線[2,3]，1中可能存在原料3和中間體6，還有1的降解產物或副產物5-乙酰大黃酸(2)、4-乙酰大黃酸(4)和大黃酸(5)，而起始原料3中可能引入七乙酰蘆薈苷(7)、八乙酰蘆薈苷(8)、大黃素(9)和三乙酰大黃素(10)等有關物質。現有報道主要采用HPLC法分析1[4—6]，所考察的有關物質主要有2、4和5[7,8]。本研究建立了HPLC法同時測定本品中的1及其9個有關物質。本法簡單、準確可靠，可有效控制產品質量。

1儀器與試藥

LC-10ATvp型高效液相色譜儀，包括LC-10ATvp型泵、SIL-10AF型自動進樣器、SPD-10Avp型紫外檢測器和LCsolutionLite工作站(日本Shimadzu公司)；2695型高效液相色譜儀和2996型二極管陣列檢測器(DAD)(美國Waters公司)。1原料藥(江西歐氏藥業有限責任公司，批號120701、120702和120703)；1(含量99.6％，批號140301)、6(含量99.2％，批號120303)和10(純度97.5％，批號100502)對照品均為本公司自制；3(含量98.0％，批號110795-201007)、5(含量100％，批號0757-200206)和9(含量100％，批號0756-200110)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；2(含量98.0％，批號110312)和4(含量97.8％，批號DAR-0707-01)對照品均購自深圳鴻科生物科技有限公司；7(含量96.2％，批號130514)和8(含量98.2％，批號130510)對照品均購自廣州優瓦儀器有限公司。乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀、磷酸和冰乙酸均為分析純，水為純化水。

2方法與結果

2.1溶液配制供試品溶液：精密稱取1原料藥10mg，置50ml量瓶中，加N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)5ml，超聲溶解，再加流動相定容，搖勻，得濃度為200g/ml的供試品溶液。自身對照液：精密量取供試品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加流動相定容，搖勻，得濃度為2g/ml的自身對照液。系統適用性溶液：精密稱取1和有關物質2～10對照品適量，用DMAC溶解，加流動相稀釋制成含1約50g/ml，含有關物質2～10約2g/ml的系統適用性溶液。

2.2色譜條件與系統適用性試驗色譜柱PhenomenexProdigy100AODS3柱(4.6mm×250mm，5m)；流動相乙腈∶0.025mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調至pH2.2)(42∶58)；檢測波長254nm；流速1ml/min；柱溫30℃；進樣量10l。取供試品溶液、自身對照液和系統適用性溶液，分別進樣，記錄色譜圖(見圖2)。結果顯示1～10間的分離度均不低于1.5，理論板數以1峰計大于6000。

2.3專屬性試驗取1原料藥10mg，用DMAC溶解，分別進行酸、堿、光照、氧化和高溫降解，將pH值調至中性后，用流動相稀釋制成200g/ml的溶液，分別進樣測定。結果表明1在上述條件下均發生不同程度的降解，各降解產物與1分離完全。其中酸、堿和氧化條件下產生的降解物分別與化合物2、4、5的保留時間相同，可能產生的途徑為1中的酯基水解產生2、4，并進一步水解產生5。光照條件下除有少量降解為2、4外，較大的降解峰可能為9，此外還有與2～10結構不同的未知降解峰；高溫與光照條件下產生的降解物種類相似，以2、4和未知降解產物為主。二者的降解途徑除酯基水解外，可能與蒽醌結構的變化有關。比較上述降解條件下的色譜圖可見，1在光照和堿性條件下穩定性較差，試驗過程中應避光且避免接觸堿溶液。用DAD檢測器驗證上述降解條件下的供試品溶液峰純度，結果顯示峰純度良好。

2.4線性試驗分別精密稱取1～10對照品適量，分別用DMAC溶解，以乙腈稀釋制成100g/ml的1～10對照品貯備液。精密量取1、2～6和8～10對照品貯備液適量，用乙腈溶解并稀釋，制成含1、2～6和8～10分別為0.2、0.6、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0g/ml的混合對照品溶液；另取7對照品貯備液，用乙腈稀釋制成濃度為0.6、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0g/ml的溶液。按“2.2”項下條件分別進樣，記錄色譜圖，以濃度c為橫坐標，峰面積A為縱坐標，進行線性回歸；再以主成分1與各有關物質2～10的線性回歸方程斜率的比值計算相對校正因子。線性回歸方程、相對校正因子(RCF)、檢測限(LOD)和定量限(LOQ)結果見表1。結果表明，1、2～6和8～10在0.2～3.0g/ml、7在0.6～3.0g/ml范圍內，峰面積與濃度的線性關系均良好。除7、8外，其他有關物質的RCF均介于0.9～1.1，故可用主成分自身對照法計算含量；如檢出有關物質7、8，則采用加校正因子的主成分自身對照法計算含量。1及其有關物質(除7外)的LOD為0.006～0.05g/ml(相當于供試品溶液濃度的0.003％～0.02％)，LOQ為0.02～0.15g/ml(相當于供試品溶液濃度的0.01％～0.075％)。有關物質7的LOD相當于供試品溶液濃度的0.085％。

2.5精密度及穩定性試驗按“2.1”項下方法制備供試品溶液，共6份，分別進樣測定，計算得有關物質2、4峰面積的RSD為1.8％、1.5％，其他有關物質均未檢出。按“2.1”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12和24h進樣測定，計算得1、2、4峰面積的RSD分別為0.2％、2.8％和1.4％，其他有關物質均未檢出。結果表明，供試品溶液在24h內穩定。

2.6有關物質加樣回收率試驗精密稱取1原料藥10mg，共11份，各置50ml量瓶中，分別加入DMAC5ml，超聲溶解。取其中2份，加流動相定容，搖勻，作為空白溶液；將另外9份分成3組，各3份，按高、中、低濃度(相當于主成分濃度的0.3％、0.2％和0.1％)分別加入2～10(7、8除外)混合對照品溶液適量，用流動相定容，搖勻，作為質控溶液。取空白溶液、質控溶液和2～10(7、8除外)混合對照品溶液，分別進樣，記錄峰面積，按外標法計算其中有關物質的含量，并計算回收率。結果表明，所考察的有關物質的平均回收率(n=9)為96.8％～99.9％，RSD為1.7％～3.5％。

2.7樣品測定按“2.1”項下方法制備供試品溶液和自身對照液，分別進樣測定，記錄色譜圖。量取供試品溶液所得色譜圖中除主峰外的各有關物質峰的峰面積，2～10(7、8除外)用主成分自身對照法計算有關物質含量，如檢出有關物質7、8，則采用加校正因子的主成分自身對照法計算含量。3批樣品測定結果見表2。結果表明，3批1原料藥中只檢出2、4，其他有關物質均未檢出，總雜質均小于0.3％。

3討論

取2～10對照品溶液，用乙腈稀釋至適宜濃度，在200～400nm波長范圍內掃描，結果表明，上述有關物質與1的紫外吸收特征相似，均在254nm處有最大吸收，且吸收值相當。故選擇254nm作為檢測波長。參考文獻[9,10]，本研究分別比較了乙腈∶0.1mol/L磷酸(40∶60，流動相Ⅰ)、乙腈∶水(用乙酸調至pH2.7)(47∶53，流動相Ⅱ)、乙腈∶0.025mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調至pH2.2)(42∶58，流動相Ⅲ)等不同體系對樣品的分離效果。流動相Ⅰ的pH值約為1.5，柱壓較高，會減少色譜柱壽命；流動相Ⅱ的分離效果良好，但乙酸易揮發不易控制pH值，且用量較大；綜合考慮，最終選用流動相Ⅲ。曾用磷酸將流動相調至pH2.0、2.2、2.5、3.0、3.5和4.0，結果顯示pH值越大，1保留時間越小。推測是由于1結構中存在羧基，顯弱酸性，pH值的改變影響其電離情況。在pH2.2時，1保留時間適中，峰形對稱，各有關物質與1分離良好。pH值增大或減小均會改變1與其他有關物質的相對保留時間，進而影響分離效果。有關物質7、8由于檢測靈敏度低，在回收率試驗濃度范圍內無法獲得準確回收率，故未列出測定結果。

作者：苑洪忠 于文國 趙孝先 姚換方 趙凱 單位：河北凱盛醫藥科技有限公司 河北醫科大學第四醫院 江西歐氏藥業有限責任公司