豬瘟病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)范文

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《中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)》2014年第八期

1材料和方法

1.1重組桿狀病毒制備將pFastBac-G-VP73轉(zhuǎn)化含有穿梭載體Bacmid的DH10Bac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過藍(lán)白斑篩選及劃線培養(yǎng)、純化陽性菌落，經(jīng)PCR鑒定后獲得重組桿粒Bacmid-G-VP73。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法，將Bacmid-G-VP73轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲細(xì)胞中，于28℃培養(yǎng)，待出現(xiàn)細(xì)胞病變后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液即含有重組桿狀病毒。

1.2重組桿狀病毒感染BHK-21細(xì)胞將重組桿狀病毒液加入細(xì)胞培養(yǎng)板中生長(zhǎng)至60%的BHK-21細(xì)胞單層中，28℃感染4h，更換培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48h。1.6Westernblot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)收集重組桿狀病毒感染48h后的BHK-21細(xì)胞，裂解后12000r/min離心5min，收集上清液，以VP73MAb為一抗，羊抗鼠IgG-HRP為二抗進(jìn)行westernblot鑒定。

2結(jié)果與討論

2.1重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-VP73的構(gòu)建以含有VP73全基因的重組質(zhì)粒為模板，采用引物P1/P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物片段約為1200bp。純化的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切回收后，克隆于pcDNA3.1中構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA-VP73。經(jīng)測(cè)序結(jié)果表明VP73基因?yàn)?188bp，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2重組穿梭載體(Bacmid-G-VP73)的構(gòu)建以pcDNA-VP73為模板，采用引物P3/P4PCR擴(kuò)增回收CMV-VP73并克隆于pFastBac-VSV/G中，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-G-VP73，經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果鑒定正確，繼而轉(zhuǎn)化DH10Bac大腸桿菌，大腸桿菌Bacmid中LacZ基因由于CMV-VP73表達(dá)盒的插入而失活從而篩選純化重組穿梭載體Bacmid-G-VP73。分別提取重組桿狀病毒與野生型病毒BacmidDNA，利用VP73基因上游引物P1和M13下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示Bacmid-G-VP73PCR產(chǎn)物大小約1800bp，而野生型病毒Bacmid對(duì)照無擴(kuò)增條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，表明CMV-VP73已經(jīng)整合重組到桿狀病毒的Bacmid中。

2.3重組桿狀病毒AcNPV-G-VP73的制備利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法，將新鮮提取的重組穿梭載體BacmidDNA轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，28℃培養(yǎng)72h，收取上清液即含有重組桿狀病毒AcNPV-G-VP73。我國以桿狀病毒為載體在其受納的昆蟲細(xì)胞中對(duì)ASFV蛋白真核表達(dá)的研究已有報(bào)道[6-7]，但利用桿狀病毒對(duì)ASFV蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的真核表達(dá)卻鮮有報(bào)道。本研究中CMV-IE啟動(dòng)子啟動(dòng)VP73基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，限制其在常規(guī)桿狀病毒受納的昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，同時(shí)利用VSV/G蛋白膜融合的活性避免病毒基因組被哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的補(bǔ)體滅活，病毒培養(yǎng)達(dá)到較高的滴度時(shí)，Sf9細(xì)胞即出現(xiàn)明顯的融合現(xiàn)象。

2.4重組桿狀病毒AcNPV-G-VP73介導(dǎo)VP73基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)將重組病毒AcNPV-G-VP73以100MOI感染BHK-21細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞蛋白，westernblot分析，該蛋白能夠與抗VP73的特異性MAb反應(yīng)，出現(xiàn)一條約為45ku的目的蛋白帶，而正常BHK-21細(xì)胞和以相同感染復(fù)數(shù)AcN-PV-G-EGFP感染的BHK-21的細(xì)胞裂解蛋白均無此特異性條帶(圖2)，結(jié)果表明VP73蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得到了表達(dá)，特異性較強(qiáng)。鑒于目前國內(nèi)外尚無有效的疫苗用于ASF防控，而且在國內(nèi)禁止引進(jìn)外來病毒，無法建立該病的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)的情況下，本研究所構(gòu)建的以桿狀病毒為載體的疫苗對(duì)于預(yù)防未來可能發(fā)生的ASF具有明顯的現(xiàn)實(shí)意義。綜上所述，本研究開展了ASF的相關(guān)儲(chǔ)備性研究，構(gòu)建了能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)ASFVVP73蛋白的重組桿狀病毒，為ASF疫苗的研究及檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

作者：靳雯雯楊曉紅朱碧波呂建強(qiáng)曹勝波單位：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心