羊傳染性膿皰病毒抗干擾素研究范文

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《中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)》2015年第十二期

摘要：

羊傳染性膿皰病毒（ORFV）是痘病毒科副痘病毒屬的成員之一，引起嚴(yán)重的人獸共患傳染病。該病毒基因組全長(zhǎng)約134～139kb，編碼130多個(gè)蛋白，抗干擾素基因是ORFV編碼的具有拮抗宿主干擾素功能的蛋白，在ORFV突破宿主免疫屏障過(guò)程中有重要作用。本文就抗干擾素基因的研究進(jìn)展作一綜述。

關(guān)鍵詞：

羊傳染性膿皰病毒；VIR基因；研究進(jìn)展

羊傳染性膿皰（俗稱(chēng)羊口瘡）是由羊傳染性膿皰病毒（Orfvirus，ORFV）感染引起的嚴(yán)重的人獸共患傳染病。ORFV含線性雙股DNA，有囊膜，屬于痘病毒科（Poxviridae），副痘病毒屬（Parapoxvir－us），可感染山羊、綿羊，也可以感染人，通常是急性感染，引起口唇、舌、鼻、乳房等部位皮膚與黏膜形成水皰、丘疹、膿皰、潰瘍，然后結(jié)成疣狀痂［1］。ORFV具有嗜上皮性，皮膚破損處容易感染并在上皮細(xì)胞中增殖。該病為自限性感染，通?；疾?dòng)物1～2個(gè)月就會(huì)康復(fù)［2］?；疾?dòng)物一般死亡率不高，但如果羔羊感染后又繼發(fā)感染或混合感染其他病毒或細(xì)菌則死亡率較高，人感染后主要表現(xiàn)為指間、手背以及手臂出現(xiàn)皰疹和破潰［3－4］。該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，我國(guó)湖北、山東、貴州、福建、黑龍江、新疆等多個(gè)省份均有該病發(fā)生，不僅給養(yǎng)羊業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重威脅人民的身體健康。ORFV基因組為線性雙股DNA，全長(zhǎng)約為134～139kb，不同毒株之間基因組長(zhǎng)度有10～25kb的差異。基因組共有16個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼大約130個(gè)基因［5］。許多痘病毒基因組富含AT，而OR－FV等副痘病毒屬的一些病毒則G＋C含量較高，約64％［6］。ORFV基因組中間有一個(gè)較長(zhǎng)的中心編碼區(qū)，主要編碼一些與病毒復(fù)制和裝配或病毒形態(tài)有關(guān)的蛋白，如RNA聚合酶等。中心編碼區(qū)以外兩端編碼一些病毒復(fù)制非必需基因，如抗干擾素基因（VIR），IL－10基因（vIL－10），血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），趨化因子結(jié)合蛋白（CBP），錨蛋白（ANK），脫氧尿苷焦磷酸酶（dUTPase），粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM－CSF）抑制因子（GIF），這些基因與ORFV宿主嗜性、致病力及免疫逃避有關(guān)［7－9］?；蚪M兩端各有3kb左右的反向末端重復(fù)序列（invertedterminalrepeat，ITR），兩端有封閉的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。ORFV基因組相對(duì)保守，不同毒株之間同源性較高，但兩端非保守區(qū)頻繁突變，同一物種的不同毒株也有較高的變異率［10］，ORFV細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)連續(xù)傳代常發(fā)現(xiàn)ITRs有基因重排現(xiàn)象，這種基因重排和缺失會(huì)導(dǎo)致病毒毒力改變［11］。VIR是ORFV感染早期表達(dá)的主要毒力因子之一，參與拮抗宿主免疫應(yīng)答，能在早期感染時(shí)為病毒的復(fù)制和增殖創(chuàng)造有利條件［12］。本文就ORFV編碼的VIR的結(jié)構(gòu)和功能等方面進(jìn)行綜述，以期闡明VIR的研究現(xiàn)狀。

1VIR的結(jié)構(gòu)與特征

VIR基因位于ORFV基因組左側(cè)距離左端20kb的位置，VIR基因比較保守，常用作比較不同毒株間的親緣關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)［13－14］。在VIR基因起始密碼子上游有痘病毒保守的啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄控制元件，并在TAA終止密碼子之后有一個(gè)痘病毒保守的早期基因轉(zhuǎn)錄終止序列T5NT。抑制病毒中晚期表達(dá)后，VIR基因仍然表達(dá)證實(shí)了該基因在感染早期表達(dá)［14］。VIR基因與牛痘病毒（Vac－cinevirus，VACV）的抗干擾素基因E3L同源，二者核苷酸序列一致性為44％，其產(chǎn)物的氨基酸序列有31％的一致性，相似性為53％［15－16］。VACV的E3L蛋白C端結(jié)構(gòu)域?yàn)閐s－RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，是VACV抗干擾素活性以及細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)適應(yīng)廣闊的宿主范圍所必需的［17－18］，N端為Z－DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與E3L蛋白核定位有關(guān)，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域由一段酸性、胰蛋白酶敏感的序列連接起來(lái)［19］，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域均為該基因致病所必需的［20］。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明VIR蛋白也是由N端的Z－DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C端的ds－RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。

2VIR編碼兩種蛋白

VIR基因在宿主細(xì)胞內(nèi)以及構(gòu)建的載體均能夠表達(dá)出兩種蛋白質(zhì)VIR以及shVIR，大小分別約為25kDa和12kDa［21］。后者的出現(xiàn)是因?yàn)閙R－NA進(jìn)行翻譯時(shí)，將起始密碼子下游的甲硫氨酸密碼子作為了起始密碼子，跳過(guò)了多肽鏈氨基端的一部分序列。將下游的AUG密碼子替換為AUU則不能產(chǎn)生shVIR。VIR與shVIR的許多特性比較相似，都可以結(jié)合dsRNA，抑制PKR活性，抑制干擾素免疫應(yīng)答等。二者在細(xì)胞中的分布不同，sh－VIR由于缺少核定位序列，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，而VIR主要分布在細(xì)胞核中。并且在小鼠模型中，只表達(dá)shVIR的重組ORFV毒力相對(duì)較弱，說(shuō)明VIR的N端結(jié)構(gòu)域與該基因的致病性有關(guān)［22］。

3VIR抑制宿主干擾素應(yīng)答

ORFV在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)出拮抗干擾素的活性，并且能夠保護(hù)其他病毒在含有I型和II型干擾素的培養(yǎng)液中增殖，ORFV的這一活性與VIR基因有關(guān)。將VIR基因的表達(dá)產(chǎn)物加入細(xì)胞上清能保護(hù)病毒在含IFN的培養(yǎng)液中增殖。病毒復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的dsRNAs是誘導(dǎo)抗病毒免疫應(yīng)答中重要的病原相關(guān)分子模式（PAMP），蛋白激酶R（proteinkinaseR，PKR）是干擾素信號(hào)通路下游重要的蛋白質(zhì)［23－24］。VIR蛋白結(jié)合dsRNA以及PKR的特性在ORFV抑制干擾素應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

3．1雙鏈RNA結(jié)合活性Haig等用大腸桿菌表達(dá)的VIR融合蛋白進(jìn)行電泳遷移率實(shí)驗(yàn)證實(shí)VIR蛋白的dsRNA結(jié)合活性［25］。許多ds－RNA結(jié)合蛋白有5個(gè)保守的氨基酸殘基F148，S166，K167，R168，K171，是結(jié)合dsRNA所必需的。這5個(gè)氨基酸殘基形成一個(gè)親水的平面作用于dsRNA的小溝［26－27］。VIR蛋白的dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域也存在這5個(gè)保守殘基。VIR蛋白相比牛痘病毒E3L蛋白有3個(gè)突變，E3L中的Q127，P142和A175，在VIR中對(duì)應(yīng)的是M119，E135，和C168，這3個(gè)突變改變了VIR蛋白dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域疏水中心的穩(wěn)定性，使VIR結(jié)合dsRNA的能力相對(duì)其他的dsRNA結(jié)合蛋白減弱［21］。

3．2抑制PKR活性VIR能夠抑制PKR活性，抑制PKR的自身磷酸化以及對(duì)翻譯起始因子eIF－2α亞基的磷酸化。正常情況下，PKR在干擾素的誘導(dǎo)作用下，與病毒dsRNA結(jié)合后發(fā)生自我磷酸化，并使翻譯起始因子eIF－2的α鏈磷酸化。磷酸化的eIF－2不能發(fā)揮其正常作用，病毒蛋白以及細(xì)胞中的蛋白質(zhì)無(wú)法合成，從而阻止病毒復(fù)制［28］。PKR還與細(xì)胞凋亡有關(guān)，VIR蛋白抑制PKR活性從而使病毒得以在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制［29］。由于PKR具有dsRNA依賴(lài)性，VIR基因的產(chǎn)物具有結(jié)合dsRNA的活性，能夠與PKR競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合dsRNA，VIR抑制PKR活性曾被認(rèn)為是該蛋白結(jié)合dsRNA從而阻斷了PKR的激活導(dǎo)致的［30］。Yeu－yangTseng等通過(guò)免疫共沉淀的方法證明了VIR以及shVIR均能夠直接與PKR結(jié)合抑制其功能的發(fā)揮［22］。

4VIR可取代VACV的E3L基因發(fā)揮作用

ORFV的VIR與同源的VACV蛋白E3L的氨基酸序列相似性只有53％，有研究將VIR基因與缺失E3L基因的VACV重組，VIR基因插入在E3L基因的位置，VIR基因能夠替代E3L的作用，重組病毒能夠抑制干擾素，適應(yīng)原來(lái)的宿主范圍，與野生型的VACV一樣復(fù)制增殖，但重組病毒的毒力相比野生型減弱，使重組病毒毒力減弱的原因主要是C端結(jié)構(gòu)域的改變［21］。VACV可以用作重組疫苗的載體以及抗癌治療［31－32］，插入VIR基因構(gòu)建的重組病毒，在組織細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)能夠有效增殖且毒力相對(duì)較弱，有潛力發(fā)展成為新一代的重組疫苗載體。

5展望

病毒復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的dsRNAs是誘導(dǎo)宿主抗病毒免疫應(yīng)答中重要的病原相關(guān)分子模式（PAMP）。許多病毒抵抗宿主抗病毒免疫的方式便是產(chǎn)生dsRNA結(jié)合蛋白，如痘病毒的E3蛋白家族、流感病毒的NS1以及埃博拉病毒的V35蛋白［33－34］。結(jié)合并阻斷病毒的dsRNAPAMP從而抑制相關(guān)的抗病毒免疫應(yīng)答是目前發(fā)現(xiàn)的許多病毒dsRNA結(jié)合蛋白的作用方式。VIR編碼的蛋白質(zhì)通過(guò)結(jié)合并阻斷病毒的dsRNAPAMP，結(jié)合并抑制干擾素信號(hào)通路中的PKR激酶，作為ORFV逃避宿主免疫的重要部分，為病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制贏得時(shí)機(jī)。進(jìn)一步深入研究VIR的功能，對(duì)于全面認(rèn)識(shí)ORFV的致病及免疫逃避的分子機(jī)制有重要作用。

作者：王玲玲 劉永杰 鄭海學(xué) 張克山 劉湘濤 單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室