鸚鵡熱衣原體的PCR檢測范文

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《畜牧與獸醫(yī)雜志》2014年第九期

1材料與方法

1.1核酸提取取衣原體、細(xì)菌培養(yǎng)液或樣本懸液200μL，加入裂解液400μL，混勻，室溫靜置2～3min，先后以酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)和氯仿各抽提1次，取上清加入0.8體積－20℃預(yù)冷的異丙醇，混勻，4℃12000r/min離心10min，沉淀用75%乙醇洗滌1次后，室溫干燥3～5min，加入超純水30μL溶解沉淀。裂解液:5mol/L異硫氰酸胍，0.05mol/LTris－HCl(pH6.4)，0.02mol/LEDTA(pH8.0)，1.3%TritonX－100，充分溶解后備用。

1.2熒光PCR熒光PCR反應(yīng)體系:TaqMan熒光PCRMasterMix12.5μL，上、下游引物(20pmol/L)各0.5μL，探針(10pmol/L)0.25μL，DNA模板5μL，加超純水至25μL。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性10min后;95℃15s、57.5℃1min，40個(gè)循環(huán)。

1.3特異性分別提取CpsCB3以及雞毒支原體、雞滑液囊支原體、豬肺炎支原體、豬鼻支原體、大腸桿菌ATCC25922、痢疾志賀菌CMCC(B)51105、沙門菌ATCC14028、金色葡萄球菌ATCC25923、銅綠假單胞菌ATCC27853、霍亂弧菌ATCC51394、副溶血弧菌89001、單增李斯特菌CMCC(B)54002、蠟樣芽孢桿菌ATCC63301、甲型溶血型鏈球菌CMCC32205、阪崎氏腸桿菌ATCC29544等的DNA。用Y1和Y2熒光PCR進(jìn)行擴(kuò)增，分析方法的特異性。

1.4靈敏度將CpsCB3基因組DNA和已知濃度的目的DN斷分別做10倍倍比稀釋，每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)，用相應(yīng)的Y1和Y2熒光PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，比較分析擴(kuò)增的靈敏度。

1.5常規(guī)PCR常規(guī)PCR反應(yīng)體系:常規(guī)PCRMasterMix12.5μL，上下游引物(濃度為20μmol/L)各0.5μL、DNA模板5μL，加超純水至25μL。C1的擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性10min，94℃30s、56℃45s、72℃45s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。C2的擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性10min，94℃30s，54℃45s、72℃45s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。X1和X2的擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性10min，94℃30s，53℃40s、72℃1min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。

1.6臨床樣品檢測從江蘇等地的5個(gè)養(yǎng)鴿場、2個(gè)豬場、2個(gè)奶牛場采取了50份鴿泄殖腔拭子、20份豬肺組織、20份牛鼻腔拭子，分別用建立的Y1、Y2熒光PCR和C1和C2常規(guī)PCR進(jìn)行檢測。

2結(jié)果

2.1熒光PCR擴(kuò)增經(jīng)過對引物和探針濃度、Mg2+和dNTPs濃度、退火溫度和時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化后，用Y1、Y2、Y3熒光PCR分別對CpsCB3、分離株1和分離株2進(jìn)行擴(kuò)增。發(fā)現(xiàn)其中Y1和Y2熒光PCR的擴(kuò)增曲線呈典型的“S”型，擴(kuò)增平臺期的熒光值(＞1.75)明顯比Y3熒光PCR(＜0.5)高，對相同濃度的同一模板進(jìn)行擴(kuò)增，Y1和Y2熒光PCR的Ct值遠(yuǎn)小于Y3熒光PCR，故選擇Y1和Y2熒光PCR用于下一步的試驗(yàn)。將Y1和Y2熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖電泳，能觀察到預(yù)期片段大小一致的單一條帶，切取目的片斷純化回收后，克隆至pMD18－TVector，送大連寶生物公司測序，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物序列與預(yù)期一致。

2.2特異性用Y1和Y2熒光PCR對CpsCB3、雞毒支原體、雞滑液囊支原體、豬肺炎支原體、豬鼻支原體以及大腸桿菌等11種細(xì)菌的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)除CpsCB3出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線外，其他均沒有擴(kuò)增曲線，說明這2套熒光PCR具有良好的特異性。

2.3靈敏度用Y1熒光PCR對10倍倍比稀釋目的DN斷進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)其檢測下限為7個(gè)拷貝，Ct值和DNA稀釋倍數(shù)的對數(shù)的相關(guān)性方程為Y=－3.52X+42.46，R2=0.999;Y2熒光PCR對目的DN斷的檢測下限為2個(gè)拷貝，相關(guān)性方程為Y=－3.34X+40.18，R2=0.995(表2)。用Y1和Y2熒光PCR對10倍倍比稀釋的CpsCB3基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)Y1的檢測下限為108稀釋倍數(shù)，相關(guān)性方程為Y=－3.49X+14.26，R2=0.989，變異系數(shù)CV(%)為0.09%～2.2%(n=3);Y2的檢測下限為107稀釋倍數(shù)，相關(guān)性方程為Y=－3.59X+13.03，R2=0.996，變異系數(shù)CV(%)為0.57%～1.8%(n=3)，說明這2套熒光PCR具有良好的靈敏度和重復(fù)性。

2.4常規(guī)PCR經(jīng)過反應(yīng)條件優(yōu)化后，用C1和C2、X1和X2常規(guī)PCR分別對CpsCB3、分離株1和分離株2進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳，能觀察到預(yù)期片段大小一致的單一條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物送大連寶生物公司測序，發(fā)現(xiàn)所有擴(kuò)增產(chǎn)物序列與預(yù)期一致。并且這4套PCR對雞毒支原體、雞滑液囊支原體、豬肺炎支原體、豬鼻支原體以及大腸桿菌等11種細(xì)菌核酸不能擴(kuò)增到目標(biāo)條帶，說明建立的方法具有良好的特異性。其中C1和C2常規(guī)PCR對目標(biāo)DN段的檢測下限依次為900拷貝和10000拷貝，對與2.3同一管CpsCB3基因組DNA溶液的檢測下限依次為105和104(表2)。

2.5初步應(yīng)用將CpsCB3、分離株1和分離株2用X1和X2PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物分別測序，結(jié)果用DNAStar軟件和NCBI網(wǎng)站上的Blast軟件進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)CpsCB3、分離株1和分離株2的16S－23SrRNA基因序列與鸚鵡熱參考株ChlamydiapsittaciMN株同源性均達(dá)99%，與其他Cps同源性為95%～99%，與其他衣原體(沙眼衣原體、肺炎衣原體和反芻動物衣原體)同源性為73%～91%;發(fā)現(xiàn)CpsCB3、分離株1和分離株2的MOMP基因序列與國際鸚鵡熱衣原體參考株MN株同源性都為77%，CpsCB3、分離株1和分離株2與已公布的CpsCB3株和CpsCB8株基因同源性均達(dá)99%。摘取GenBank中已報(bào)道的衣原體基因中對應(yīng)X1和X2目標(biāo)片段的序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)X1和X2的擴(kuò)增片段能有效將Cps區(qū)分于其他衣原體。用Y1、Y2熒光pcr和C1、C2常規(guī)PCR檢測了來源于江蘇等地的50份鴿泄殖腔拭子、20份豬肺組織和20份牛鼻腔拭子，結(jié)果均為陰性。說明建立的方法可用于臨床樣本的檢測和分析。

3討論

衣原體介于病毒和細(xì)菌之間，兼有細(xì)菌和病毒兩者的基本生物學(xué)特性，直徑0.2～1.5μm，由始體和網(wǎng)狀體兩個(gè)生長期組成，主要靠空氣傳播和接觸傳播［8］。目前比較公認(rèn)的是分為4個(gè)種:沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、肺炎衣原體和反芻動物衣原體［9］。其中鸚鵡熱衣原體分為禽源群、貓?jiān)慈骸⒘鳟a(chǎn)源群和豚鼠源群4個(gè)群、8個(gè)血清型，即A、B、C、D、E、F、WC和M56，也有學(xué)者認(rèn)為禽源性鸚鵡熱衣原體就有6個(gè)血清型［10］。近年來，隨著候鳥遷徙，寵物鳥的增加，動物發(fā)病和人感染的報(bào)道呈逐年上升趨勢，因此鸚鵡熱衣原體對畜牧業(yè)和人類的危害值得警惕。

鸚鵡熱衣原體全基因組約為1170kb，其中16S－23SrRNA與外膜主蛋白(MOMP)的基因序列比較保守。衣原體的16S－23SrRNA基因高度保守，且種屬間差異不大(同源性為90%以上)，如果將其作為檢測的目的基因，不易區(qū)分不同種的衣原體。鸚鵡熱衣原體MOMP與沙眼衣原體、肺炎衣原體MOMP的同源性分別為68%和71%［11］，MOMP有4個(gè)基因可變區(qū)(VDs)分別介于5個(gè)高度保守的恒定區(qū)之間，其中VD1與VD2區(qū)具有血清型特異的抗原決定簇，VD4區(qū)具有種屬特異性的抗原簇，MOMP抗原決定簇對其毒力和致病性研究以及疫苗研制方面具有重要意義［12］。目前鸚鵡熱衣原體檢測方法主要有病原分離鑒定、免疫熒光［13］、間接血凝抑制試驗(yàn)［14］、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)［15］、ELISA［16］、常規(guī)PCR［17］、熒光PCR(包括雙雜交探針的熒光PCR［18］、SYBRGreen熒光PCR［19］和MGB熒光PCR［20］)等。其中病原分離鑒定、免疫熒光、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、間接血凝抑制試驗(yàn)等的耗時(shí)長、敏感性較低、易受主客觀因素影響;SYBRGreen熒光PCR的特異性和靈敏度低于探針類的熒光PCR，MGB熒光PCR對探針匹配性的要求極高，而鸚鵡熱衣原體內(nèi)的群和血清型較多，各群各型之間存在一定的基因差異，并且野毒株之間也存在一定的變異，一旦出現(xiàn)某個(gè)堿基與MGB探針不匹配，就可能呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，有漏檢的可能。本研究建立的2套鸚鵡熱衣原體TaqMan熒光PCR具有良好的特異性、靈敏度和重復(fù)性，對基因組和雙鏈目標(biāo)DNA的檢測下限明顯優(yōu)于常規(guī)PCR，因此，檢測時(shí)建議優(yōu)先選用TaqMan熒光PCR。由于鸚鵡熱衣原體和沙眼衣原體、肺炎衣原體、反芻動物衣原體之間的基因序列同源性比較高，衣原體各種之間的序列差異區(qū)在鸚鵡熱衣原體不同毒株之間也存在一定差異，因此，不易設(shè)計(jì)鸚鵡熱衣原體特異性的引物和探針。本研究經(jīng)過反復(fù)比對，設(shè)計(jì)的引物和探針與其他衣原體的序列差異為2～10個(gè)堿基。由于鸚鵡熱衣原體的宿主種類繁多，很多宿主也能感染其他衣原體，為確保檢測的準(zhǔn)確性，本研究進(jìn)一步設(shè)計(jì)并建立了2套衣原體科的通用PCR，其包含可將鸚鵡熱衣原體與其他衣原體區(qū)分的可變區(qū)，一旦熒光PCR檢測出現(xiàn)陽性結(jié)果，可用衣原體通用PCR對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，進(jìn)一步鑒別確認(rèn)。筆者認(rèn)為可先對樣本用具有快速、靈敏等特點(diǎn)且基因位點(diǎn)不同的2套熒光PCR進(jìn)行檢測，即能對大量樣本進(jìn)行快速初篩，還可避免漏檢;而后再用衣原體通用PCR進(jìn)行序列確認(rèn)，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，避免誤檢。總之，本文建立的方法具有較好的應(yīng)用前景，可為鸚鵡熱衣原體的大范圍初篩和快速診斷提有效手段，為鸚鵡熱衣原體的日常監(jiān)測、流行病學(xué)調(diào)查和防控提供可行之策。

作者：唐泰山王建忠陳國強(qiáng)馬雪麗姚火春張常印姜焱王凱民單位：江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局蘇州市相城區(qū)畜牧獸醫(yī)站南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院