精子中段形態(tài)對(duì)胚胎發(fā)育的影響范文

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《南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》2016年第二期

摘要：

目的在高倍鏡下觀察精子中段的形態(tài)，從而評(píng)估精子中心體功能，從而探討精子中段形態(tài)與中心體功能的關(guān)系以及中段形態(tài)不同的精子對(duì)胚胎發(fā)育的影響。方法針對(duì)57例在成都市錦江區(qū)婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心行ICS（I卵胞漿內(nèi)單精子注射）技術(shù)治療的患者，將首先在低倍鏡（×200~×400）下挑選過(guò)的精子再次利用MSOME（精子細(xì)胞器官形態(tài)學(xué)檢查）系統(tǒng)，在6000倍放大鏡下對(duì)精子進(jìn)行精子中心體形態(tài)分組（A組：1≤a/b≤1.2；B組：a/b≥1.5；C組：其他不規(guī)則形態(tài)），然后分別將這3組精子注射入卵后，分組進(jìn)行胚胎培養(yǎng)，最終觀察每組胚胎發(fā)育和著床情況。結(jié)果A，B，C3組比較發(fā)現(xiàn)D3移植優(yōu)胚率（79.7%vs55.6%vs33.3%）和胚胎著床率（43.2%vs11.1%vs0%）在3組之間均有顯著性差異（P<0.05）；而正常受精率（73.3%vs80.4%vs63.5%）、囊胚利用率（23.2%vs22.2%vs9.09%）、胚胎冷凍率（29.2%vs25.0%vs13.0%）、D3優(yōu)胚率（35.3%vs37.8%vs18.8%）上均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。結(jié)論中心體形態(tài)較好的精子注射入卵后，可獲得較高正常受精的胚胎，能顯著提高第3天可移植優(yōu)胚的幾率，同時(shí)能顯著改善胚胎的著床率，但由于樣本量較少，仍然需要較大的樣本量來(lái)進(jìn)一步證實(shí)，為精子中心體的相關(guān)研究提供參考。

關(guān)鍵詞：

卵胞漿內(nèi)單精子注射；精子細(xì)胞器官形態(tài)學(xué)檢查；中心體；胚胎

中心體是所有真核生物體內(nèi)都存在的一種微管結(jié)構(gòu)［1-2］，由典型的9條對(duì)稱的粗纖維組成纖維帶，長(zhǎng)500nm，直徑275nm［3］。精子形成過(guò)程中，精子中心體丟失大部分中心粒周圍的基質(zhì)（PCM）并保留微管結(jié)構(gòu)［4］。成熟精子在精子頭尾處有兩個(gè)相互垂直的中心粒，即近端中心粒和遠(yuǎn)端中心粒，后者在精子形成過(guò)程中逐步退化［5］。對(duì)多數(shù)脊椎動(dòng)物而言，中心體遺傳屬于父源性遺傳［5-6］，精子入卵后，以中心粒為中心逐步形成精星體，同時(shí)在精星體的牽引下雌雄原核逐漸靠近并融合。中心粒與卵子中的PCM形成新的中心體，且復(fù)制始于原核期，合子的中心體將成為體細(xì)胞中心體的前身。對(duì)曾進(jìn)行過(guò)ICSI治療且受精失敗的接受輔助生育技術(shù)（ART）患者的卵母細(xì)胞研究后發(fā)現(xiàn)，受精受阻可能是因精子中心體功能異常所致［8］，由此可見精子中心體在受精過(guò)程中扮演著極其重要的角色［9］。為此，需要研究者進(jìn)行有關(guān)精子中心體功能的相關(guān)研究。2002年，Nakamura等［10］利用不同中心體結(jié)構(gòu)異常的精子注射入卵母細(xì)胞來(lái)評(píng)估其功能，研究結(jié)果認(rèn)為受精失敗可能是精子中心體功能異常所致。導(dǎo)致輔助生育治療患者受精失敗的影響因素較多，其中纖維鞘異常（DFS）是一種很少見的畸形，DFS的精子喪失其運(yùn)動(dòng)能力以及精子中心體異常都會(huì)導(dǎo)致受精失?。?1］。隨著顯微鏡技術(shù)的不斷發(fā)展，精子形態(tài)對(duì)于輔助生育結(jié)局的影響越來(lái)越受到業(yè)內(nèi)人士的重視，比如精子頭部空泡、精子中段形態(tài)等。那么，精子中段形態(tài)與其中心體功能的關(guān)系以及不同中段形態(tài)是否對(duì)輔助生育結(jié)局產(chǎn)生影響等這些問(wèn)題引起了我們的關(guān)注，并希望通過(guò)本實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)MSOME技術(shù)能否通過(guò)挑選某種中段形態(tài)的精子進(jìn)行顯微注射，從而獲得更好的助孕結(jié)局。本研究利用精子放大系統(tǒng)將精子放大6000倍觀察后，按照精子中段形態(tài)將這些精子分為3組A組：1≤a/b≤1.2；B組：a/b≥1.5；C組：其他形態(tài)不規(guī)則（a/b表示精子中段近端直徑/遠(yuǎn)端直徑），并將每組精子分別注射入卵后觀察卵子的正常受精情況、胚胎發(fā)育情況和胚胎著床情況，這是國(guó)內(nèi)首次對(duì)ART患者嘗試從精子形態(tài)學(xué)角度評(píng)估精子中心體功能，以及精子中段形態(tài)對(duì)胚胎發(fā)育的影響。

1資料和方法

1.1資料

1.1.1研究對(duì)象觀察2014年1~11月在成都錦江婦幼保健院行ICSI治療的57例患者（含9例重復(fù)周期）?；颊叽倥怕逊桨笧槲以簶?biāo)準(zhǔn)方案。我院行ICSI患者的指征［12］：（1）嚴(yán)重少、弱、畸精子癥；（2）不可逆的梗阻性無(wú)精子癥；（3）生精功能障礙（排除遺傳缺陷疾病所致）；（4）男性免疫性不育；（4）體外受精失敗；精子頂體異常。

1.1.2研究對(duì)象分組57例研究對(duì)象的精子標(biāo)本按照MSOME高倍鏡（×6000）觀察下中心體形態(tài)進(jìn)行分組。高倍鏡下觀察到精子的中段形態(tài)可分為3組：A組：1≤a/b≤1.2；B組：a/b≥1.5；C組：其他形態(tài)不規(guī)則（a/b表示精子中段近端直徑/遠(yuǎn)端直徑）（圖1）［14］。1.2方法1.2.1卵母細(xì)胞的采集與處理標(biāo)準(zhǔn)方案：黃體中期肌注GnRHa0.05mg（達(dá)必佳，F(xiàn)ERRING,Swiss），14d后rFSH150~300U刺激卵巢（果納芬，Merck，Germany），隨后B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況，優(yōu)勢(shì)卵泡≥18mm后，肌注HCG250mg（艾澤，Merck，德國(guó)），36h后B超下經(jīng)陰道穿刺取卵。取卵至少2h后，利用透明質(zhì)酸酶（Hyaluronidase，80U/mL，Sage，USA）脫顆粒細(xì)胞后，置于微滴（G-IVF，Vitrolife，Swedish）中培養(yǎng)，并將培養(yǎng)皿放置于37℃、6%CO2的培養(yǎng)箱（ThermoScientificForma3110，USA）。

1.2.2精子的處理患者精液采用梯度離心法或直接離心法處理，處理后的精子與精子緩沖液（spermrinse，Vitrolife，Swedish）混勻，放入37℃、6%CO2的培養(yǎng)箱（ThermoScientificForma3110，USA）中備用。

1.2.3低倍鏡下挑選精子過(guò)程將處理后的精液吸取少許加入注射皿中的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或緩沖液液滴里，然后在400倍顯微鏡（NIKONTE-2000U，日本）下挑選精子形態(tài)正常的精子（挑選時(shí)主要觀察指標(biāo)：精子頂體形態(tài)、頭部形態(tài)、頸部形態(tài)及頸部液滴、尾部形態(tài)，要盡量挑選前向運(yùn)動(dòng)的精子，如果死精子較多時(shí)可選微動(dòng)精子或尾部彎曲的精子），觀察到所要挑選的精子后，用注射針在精子尾部靠近頭部的1/3處迅速制動(dòng)（當(dāng)看到精子尾部明顯折痕時(shí)，表示制動(dòng)完成），隨后，從尾部吸入被制動(dòng)的精子放置在PVP標(biāo)記過(guò)的位置，待下一步精子放大系統(tǒng)觀察所挑選精子。

1.2.4精子放大系統(tǒng)精子在低倍鏡下挑選好后，利用精子放大系統(tǒng)對(duì)精子進(jìn)行再次放大觀察［13］并拍照，然后測(cè)量精子中段形態(tài)（分A、B、C3組）［14］（圖2）。再次放大觀察過(guò)程中不會(huì)對(duì)患者精子造成任何損傷，另外觀察結(jié)束后依然按照低倍鏡下挑選好的精子進(jìn)行注射，隨后根據(jù)注射順序進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)。

1.2.5胚胎培養(yǎng)及質(zhì)量評(píng)估本實(shí)驗(yàn)室胚胎培養(yǎng)均置于37℃、6%CO2中進(jìn)行序貫培養(yǎng)（卵裂期胚胎用G-1/囊胚用G-2，Vitrolife，Swedish）。注射后16~20h觀察卵子受精情況（兩原核視為正常受精）。D3胚胎參考WIH［15］評(píng)分法，囊胚參考Gardner［16］評(píng)分法來(lái)對(duì)患者胚胎進(jìn)行評(píng)分。

1.2.6胚胎移植與妊娠結(jié)果判斷患者移植胚胎后14d尿檢hCG，陽(yáng)性患者2周后行陰道超聲檢查，發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)孕囊則判定為臨床妊娠。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，采用單向方差分析，計(jì)數(shù)資料百分率采用R×C表卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同中段形態(tài)的精子與胚胎發(fā)育不同中段形態(tài)的精子注射入卵后，A，B，C3組中正常受精率、D3優(yōu)胚率、可用囊胚率、胚胎冷凍率均無(wú)顯著性差異（P>0.05，表1）。

2.2不同中段形態(tài)的精子注射入卵后胚胎著床情況研究結(jié)果表明，D3移植優(yōu)胚率和胚胎著床率具有顯著性差異（P<0.05，表2）。

3討論

部分哺乳動(dòng)物（比如豬、人等［21-22］）已被證實(shí)中心體的遺傳屬于父源性遺傳。對(duì)于人類而言，男性精子在形成的過(guò)程中，初始精原細(xì)胞中典型的中心體結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)逐步降解以及較為復(fù)雜的修飾作用后，最終成熟精子中僅僅保留了近端中心粒［22］，當(dāng)卵母細(xì)胞被精子激活后，排出第二極體，精子近端中心粒與卵子胞質(zhì)中的中心體基質(zhì)進(jìn)行重組，此時(shí)以精子頸部中段的中心粒為中心形成精星體［19-21］，在精星體的牽引下，雌雄原核逐漸靠近最終融合形成受精卵。中心粒在原核期開始復(fù)制后均分至第1次胚胎分裂的紡錘體兩極，合子的中心體是胚胎、胎兒和成年體細(xì)胞中心體的前身［15］。本文中，不同中心體形態(tài)的精子注射入卵后，盡管統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著，但從數(shù)據(jù)上看存在著一定的差異，中心體形態(tài)較差的精子注射后，正常受精率較低，僅為63.5%。因此，精子中心體對(duì)于卵母細(xì)胞的正常受精，精星體的形成以及雌雄原核的形成起著關(guān)鍵性的作用。隨著對(duì)精子形態(tài)研究的不斷深入，掃描電鏡下觀察精子給了我們很多有趣的提示-精子形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)也許存在某種關(guān)聯(lián)，因?yàn)閮?nèi)部結(jié)構(gòu)異常往往伴隨著形態(tài)異常，比如圓頭精子，當(dāng)對(duì)其內(nèi)部遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性進(jìn)行相關(guān)研究時(shí)證實(shí)圓頭精子多表現(xiàn)出紊亂的染色質(zhì)狀態(tài)以及異常的染色體結(jié)構(gòu)［14,17-18］。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)低倍鏡（×400）下精子活力正常，但高倍鏡（×6000）下觀察到精子中段形態(tài)呈錐形時(shí)，該類精子注射入牛卵后精星體形成率較低，選擇中段較直的精子，有利于改善精星體的形成率［17］。該結(jié)論與本研究相吻合，本文對(duì)精子中心體不同形態(tài)注射入卵后，觀察卵子的受精情況，結(jié)果顯示，精子中心體形態(tài)較好的AB組精子注射后，受精率分別為80%和73%，明顯高于C組的受精情況。從這些研究推測(cè)精子中段形態(tài)異?？赡軙?huì)導(dǎo)致精子中心體功能異常。研究精子中心體功能最好的方法是將不同精子注射入卵，觀察精星體的形成，該類試驗(yàn)多用哺乳動(dòng)物的卵子進(jìn)行研究。Rawe等［23］利用不育男性精子注射入牛卵，每條精子在注射入卵后均在頸部形成精星體，隨后形成多個(gè)有絲分裂的紡錘體，但是未見多極紡錘體。而孤雌激活的牛卵子中未見微管結(jié)構(gòu)，由此推斷當(dāng)人精子注射入牛卵時(shí)，精子中心體可能對(duì)受精過(guò)程發(fā)揮極其重要的作用。

另外，研究者對(duì)圓頭精子患者和DFS的不育患者精子與有生育能力的男性精子相比，圓頭精子癥患者形態(tài)異常的精子注射入卵后精星體形成率低于后者，同時(shí)還觀察到精子中段形態(tài)異常的精子注射入卵后所形成的中心體排列絮亂［24］。上述的研究表明，精子中心體功能可能與精子中段形態(tài)存在某種相關(guān)性。形態(tài)較差的精子其中心體功能可能存在異常。另外有研究者利用形態(tài)選擇性胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)（IMSI）對(duì)精液參數(shù)正常者、少弱精子癥患者、少弱畸精子癥患者精子進(jìn)行形態(tài)挑選后檢測(cè)精子中DNA碎片率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3組分別為21.1%、31.8%和54.1%，結(jié)果提示精液參數(shù)和精子DNA碎片率相關(guān)［24］。Him等［25］將少弱畸精癥患者分為兩組，一組進(jìn)行傳統(tǒng)的ICSI治療；另一組將在MSOME放大系統(tǒng)下對(duì)精子進(jìn)行更細(xì)微的形態(tài)學(xué)觀察，挑選出形態(tài)最佳的精子進(jìn)行注射。最終對(duì)IMSI和ICSI治療后的助孕結(jié)局進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者受精率無(wú)顯著性差異，臨床妊娠率和著床率均差異顯著。與此同時(shí)本文中不同中心體形態(tài)的精子注射后，移植優(yōu)質(zhì)胚胎率和胚胎著床率均差異顯著（P<0.05）。這些研究結(jié)果提示我們，從精子形態(tài)學(xué)角度出發(fā)，精子的形態(tài)多樣性可能與某些內(nèi)部結(jié)構(gòu)的不同狀態(tài)存在緊密聯(lián)系，當(dāng)利用更加精確的精子挑選系統(tǒng)對(duì)精子進(jìn)行觀察及分類后，將不同形態(tài)的精子注射入卵母細(xì)胞會(huì)得到不同的助孕結(jié)局。從而本研究中并未對(duì)患者進(jìn)行篩選，僅僅從精子中段形態(tài)角度考察其中心體功能，并最終觀察不同中段形態(tài)對(duì)助孕結(jié)局是否產(chǎn)生影響。研究結(jié)果顯示，精子中段形態(tài)不規(guī)則的精子，注射入卵后正常受精率有所下降，尤其是精子中段形態(tài)不規(guī)則的精子，其正常受精率僅為63.5%，由此可推斷精子中段形態(tài)的變化會(huì)影響精卵的正常受精，本研究由于樣本量較少，這一結(jié)果并沒(méi)有表現(xiàn)出顯著性差異，我們需要進(jìn)一步累計(jì)較多的臨床數(shù)據(jù)再進(jìn)行進(jìn)一步分析。

精子中心體不僅在受精過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，Yoshinmoto等［26］用不育患者的精子注入牛卵母細(xì)胞中來(lái)評(píng)估精子中心體功能，發(fā)現(xiàn)早期的胚胎卵裂及后期的種植、妊娠過(guò)程與中心體功能存在聯(lián)系，正常情況下胚胎進(jìn)行對(duì)等分裂，分裂中每個(gè)卵裂球都含1個(gè)中心體和1套染色體，當(dāng)中心體功能異常時(shí)，胚胎發(fā)生不均等分裂，可能有1或2個(gè)卵裂球無(wú)細(xì)胞核，這也表明中心體功能對(duì)早期胚胎的分裂發(fā)育也產(chǎn)生一定的影響。早起胚胎發(fā)育過(guò)程中卵裂球的分裂往往呈幾何倍數(shù)增長(zhǎng)，但是在日常胚胎實(shí)驗(yàn)室工作中經(jīng)常會(huì)觀察到D2胚胎的卵裂球數(shù)呈奇數(shù)，其中部分卵裂球中并未觀察到原核，該現(xiàn)象有時(shí)在囊胚階段也能觀察到［27-28］。Kim等［29］研究表明，將患者精子行ICSI注入卵中精星體的形成始于精子頸部，如果注射精子僅僅是精子頭部時(shí)，精星體的形成始于卵子，此時(shí)形成的胚胎類似于孤雌激活的胚胎。本研究中精子中心體形態(tài)為C組的D3優(yōu)胚率和囊胚形成率分別為18.8%和9.09%，均低于A、B兩組，盡管C組中正常受精率為63.5%，但是后續(xù)的胚胎發(fā)育潛能欠缺，同時(shí)移植3例患者中9枚胚胎均來(lái)自C組的精子注射入卵形成胚胎，無(wú)一例胚胎著床。研究結(jié)果提示我們是不是精子中心體形態(tài)除了影響精星體的形成外，參與的后續(xù)的胚胎發(fā)育情況，這一結(jié)論也驗(yàn)證了Yoshinmoto等學(xué)者的推斷［26］。由于樣本量較少，對(duì)與該假設(shè)仍然需要進(jìn)一步的積累并證實(shí)。可以肯定的是利用精子放大系統(tǒng)選擇那些精子中段較直的精子注射入卵，能獲得較為理想的正常受精率。

作者：孟祥黔 龔藝 黃軍 曾永梅 全松 鐘影 單位：四川省成都市錦江區(qū)婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心