佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠骨代謝標(biāo)志物探討范文

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《廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)》2015年第六期

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoidarthritis，RA）是一種以慢性破環(huán)性關(guān)節(jié)病變?yōu)樘卣鞯娜硇宰陨砻庖卟?。其基本病理改變?yōu)榛ぱ?，表現(xiàn)為滑膜的血管增生和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及滑膜炎導(dǎo)致的滑膜、軟骨乃至軟骨下骨組織的破壞。臨床上，以南蛇藤為主要藥物組成的斷藤益母湯是治療RA的有效藥物，既往實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)其具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用［2］。佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）大鼠的病理改變與RA具有相似或相近的臨床表現(xiàn)、病理、免疫等特點(diǎn)，是研究RA的較理想模型［3］。血清Ⅰ型膠原羧基末端肽（CTX-Ⅰ）是Ⅰ型膠原蛋白的羧基末端降解產(chǎn)物，是骨重吸收標(biāo)志物。骨Ⅰ型前膠原氨基端前肽（PⅠNP）反映新合成的Ⅰ型膠原蛋白的變化，是骨形成標(biāo)志物。這2個(gè)指標(biāo)能較靈敏地反映骨吸收與重建。本研究通過(guò)觀測(cè)單藥南蛇藤煎劑、斷藤益母湯煎劑、甲氨蝶呤（MTX）對(duì)AA病理模型大鼠的關(guān)節(jié)腫脹度、關(guān)節(jié)X線評(píng)分、血清CTX-Ⅰ、PⅠNP的影響，探討斷藤益母湯對(duì)完全弗氏佐劑致敏病理模型大鼠關(guān)節(jié)骨吸收、重建的作用，為斷藤益母湯的組方提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雌性SD大鼠72只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK粵2013-0092。

1．2藥物、試劑與儀器南蛇藤(廣州嶺南中藥飲片有限公司，批號(hào)：140301)；益母草(廣東省藥材公司中藥飲片廠，批號(hào)：85313711)；續(xù)斷(康美藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：140107421)；甲氨蝶呤片（上海信誼藥廠有限公司，批號(hào)：036130706）；完全弗氏佐劑(美國(guó)Sigma公司)；CTX-Ⅰ酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒及PⅠNPELISA試劑盒（武漢華美公司）；FA204B型電子精密天平(上海皖衡電子儀器有限公司)；680型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；PV-200型足趾容積測(cè)量?jī)x(成都泰盟科技有限公司)；EQ.0•5pb/40KY型鉬靶機(jī)(意大利吉特公司)；LABY01型高速低溫離心機(jī)(廣州天臣實(shí)驗(yàn)室有限公司)。

1．3藥物的制備與劑量單方和復(fù)方的高、中、低劑量組分別給予臨床等效劑量換算后的10、5、1倍藥量，其中單方為南蛇藤煎劑，復(fù)方為斷藤益母湯煎劑。單方高、中、低劑量組給藥劑量為南蛇藤47、23.5、4.7g•kg-1•d-1，復(fù)方高、中、低劑量組給予南蛇藤47、23.5、4.7g•kg-1•d-1+續(xù)斷16、8、1.6g•kg-1•d-1+益母草31、15.5、3.1g•kg-1•d-1。煎煮方法：南蛇藤先煎3.5h，加入續(xù)斷和益母草同煎1h，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院煎藥室煎至特定用量，裝瓶放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩TX組給予MTX片1.06mg/kg，每周1次，溶于生理鹽水配至所需用量。

1.4分組、造模與給藥將72只SD大鼠隨機(jī)分為9組，即空白組、模型組、MTX組、單方低劑量組（單低組）、單方中劑量組（單中組）、單方高劑量組（單高組）、復(fù)方低劑量組（復(fù)低組）、復(fù)方中劑量組（復(fù)中組）和復(fù)方高劑量組（復(fù)高組），每組均為8只。適應(yīng)性喂養(yǎng)3d。參照文獻(xiàn)［3］方法，除空白組外，其他組大鼠于右足趾皮下注射完全弗氏佐劑0.15mL。造模當(dāng)天開(kāi)始灌胃給藥?？瞻捉M、模型組給予生理鹽水10mL•kg-1•d-1，中藥組給予對(duì)應(yīng)中藥10mL•kg-1•d-1，MTX組給予MTX水溶液每周10mL•kg-1。給藥36d。

1.5關(guān)節(jié)腫脹的觀察采用容積法測(cè)量并計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹度，關(guān)節(jié)腫脹度（%）=（注射后所測(cè)值-注射前所測(cè)值）/注射前所測(cè)值×100%。

1.6血清CTX-I、PⅠNP水平檢測(cè)給藥36d后腹主動(dòng)脈采血，采用ELISA法檢測(cè)血清CTX-Ⅰ、PⅠNP水平。步驟如下：全血標(biāo)本離心取上清用樣本稀釋液1∶20倍稀釋后待檢；配置標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液；分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔加樣；按棄液、甩干、洗版步驟，依次加入生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液，然后依序每孔先后加入底物溶液、終止溶液；反應(yīng)終止后5min內(nèi)采用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔的光密度（D）值；最后用標(biāo)準(zhǔn)品濃度與D值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣本的D值代入方程式，計(jì)算出樣本濃度。

1.7踝關(guān)節(jié)X線片評(píng)價(jià)取大鼠右足，采用鉬靶X線檢測(cè)，由影像學(xué)醫(yī)生盲法閱片后評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)推薦的放射學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［1］。0分：正常；1分：X線檢查無(wú)破壞性改變，可見(jiàn)骨質(zhì)疏松；2分：表現(xiàn)骨質(zhì)疏松，可有輕度軟骨破壞，有或沒(méi)有輕度的軟骨下骨質(zhì)破壞，可見(jiàn)關(guān)節(jié)活動(dòng)受限，但無(wú)畸形；3分：骨質(zhì)疏松加上軟骨或骨質(zhì)破壞，關(guān)節(jié)畸形，無(wú)纖維性或骨性強(qiáng)直；4分：纖維性或骨性強(qiáng)直。

1.8統(tǒng)計(jì)方法計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。統(tǒng)計(jì)軟件用SPSS19.0，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析，以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組足腫脹度表1結(jié)果顯示：模型組大鼠足腫脹度顯著增加，與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，給藥36d后，各給藥組足腫脹度顯著降低，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），各給藥組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2各組踝關(guān)節(jié)X線片評(píng)分表2結(jié)果顯示：模型組踝關(guān)節(jié)X線片均出現(xiàn)明顯的關(guān)節(jié)破壞，部分甚至出現(xiàn)纖維性或骨性強(qiáng)直，X線評(píng)分與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。各給藥組X線評(píng)分與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），各給藥組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。2.3各組血清CTX-Ⅰ、PⅠNP水平表3結(jié)果顯示：模型組CTX-Ⅰ水平顯著高于空白組（P＜0.05）；MTX組、復(fù)方低劑量組可顯著降低CTX-Ⅰ水平，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組間PⅠNP水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3討論

本研究造模后AA模型組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度、X線評(píng)分均較空白組顯著升高（P＜0.05），表明造模成功。各給藥組AA大鼠關(guān)節(jié)腫脹度、X線評(píng)分顯著降低，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中藥組與MTX組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示南蛇藤單藥煎劑，南蛇藤配伍續(xù)斷、益母草均能有效抗炎、消腫，減輕骨破壞、保護(hù)骨質(zhì)，其有效程度與MTX相仿，與既往研究結(jié)果相符。各中藥組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度、X線評(píng)分組間呈現(xiàn)一定量效趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與觀測(cè)時(shí)間短有關(guān)。各組間PⅠNP水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析其原因可能與以下因素有關(guān)：PⅠNP較穩(wěn)定地反映骨形成的水平，能長(zhǎng)時(shí)間存在于血液循環(huán)中。因本研究時(shí)間短，PⅠNP未能完全反映各組間骨重建差異。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道臨床觀測(cè)CTX-Ⅰ水平下降，但PⅠNP指標(biāo)仍維持穩(wěn)定，可為之佐證。

模型組CTX-Ⅰ水平顯著高于空白組（P＜0.05），與文獻(xiàn)報(bào)道類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的血清CTX-Ⅰ水平與關(guān)節(jié)破壞嚴(yán)重程度正相關(guān)的結(jié)論一致。血清CTX-Ⅰ水平對(duì)治療反應(yīng)敏感，MTX組CTX-Ⅰ水平與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，較好地反映MTX的治療作用。中藥組中除復(fù)方低劑量組外，其他各中藥組CTX-Ⅰ水平與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)大鼠足腫脹度和X線評(píng)分的觀察結(jié)果顯示各中藥組的治療作用明確，可控制關(guān)節(jié)炎癥和阻止骨破壞，其效果與MTX相仿。但中藥組CTX-Ⅰ水平升高未能反映中藥組的治療作用，分析可能與CTX-Ⅰ并不僅僅單純受局部關(guān)節(jié)的骨吸收影響，同時(shí)還受全身骨代謝影響有關(guān)，可能原因如下：骨吸收標(biāo)志物CTX-Ⅰ是破骨細(xì)胞活動(dòng)及骨吸收時(shí)的代謝產(chǎn)物，特別是骨基質(zhì)降解產(chǎn)物，反映關(guān)節(jié)局部及全身骨代謝水平。換言之，CTX-Ⅰ水平除能反映關(guān)節(jié)骨破壞情況外，同時(shí)受全身骨代謝影響。南蛇藤系衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，在臨床上雷公藤類制劑具有卵巢毒性為人熟知，實(shí)驗(yàn)證實(shí)雷公藤制劑連續(xù)灌胃14~15d即可導(dǎo)致大鼠卵巢早衰。本研究大鼠為雌性大鼠，南蛇藤煎劑喂養(yǎng)36d，較以往文獻(xiàn)15d左右造成大鼠卵巢早衰模型時(shí)間更長(zhǎng)。

另外研究證實(shí)卵巢切除后雌性大鼠出現(xiàn)骨吸收伴隨骨轉(zhuǎn)換增強(qiáng)，類似于人正常絕經(jīng)時(shí)骨丟失狀態(tài)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后女性CTX-Ⅰ水平顯著高于絕經(jīng)前女性。由此分析，中藥組（除復(fù)低組外）CTX-Ⅰ水平升高，可能因?yàn)榇笫笕砉俏赵黾訉?duì)于CTX-Ⅰ水平影響遠(yuǎn)大于關(guān)節(jié)局部；模型組與空白組因無(wú)全身骨吸收的影響，其CTX-Ⅰ水平可以反映局部關(guān)節(jié)破壞情況。引起大鼠全身骨吸收增加原因，分析與南蛇藤的卵巢毒性造成大鼠骨吸收增加有關(guān)。提示進(jìn)一步的研究中應(yīng)采用去勢(shì)大鼠的方法，避免南蛇藤卵巢毒性對(duì)于骨代謝標(biāo)志物的干擾。斷藤益母湯復(fù)低組CTX-Ⅰ水平與空白組、MTX組相當(dāng)，低于中藥組內(nèi)其余各組，提示南蛇藤加入川續(xù)斷、益母草配伍后對(duì)于總骨吸收水平有降低作用，但隨南蛇藤濃度提高，其作用消失。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬痹證范疇，南蛇藤具有祛風(fēng)勝濕、行氣活血、消腫解毒功效，與之合拍；肝主筋、腎主骨，肝腎內(nèi)虛為痹證內(nèi)因，故加川續(xù)斷功效補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨；針對(duì)南蛇藤的卵巢毒性，加益母草活血調(diào)經(jīng)，利水消腫。既往實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)續(xù)斷有抑制去卵巢大鼠骨吸收、防治骨質(zhì)疏松作用，益母草總黃酮可升高去卵巢大鼠血清中雌二醇水平、椎骨骨密度、下丘腦和海馬雌激素受體α、βmRNA表達(dá)。復(fù)低組CTX-Ⅰ水平下降可能與川續(xù)斷抑制骨吸收，益母草提高雌二醇水平、雌激素受體水平有關(guān)。本研究雖然未直接測(cè)定大鼠性激素、骨密度等指標(biāo)，但通過(guò)CTX-Ⅰ水平可側(cè)面反映南蛇藤配伍川續(xù)斷、益母草具有一定減毒作用。復(fù)中組、復(fù)高組的CTX-Ⅰ水平升高，未顯示出川續(xù)斷、益母草抑制總體骨吸收的量效關(guān)系，可能與隨著南蛇藤濃度提高其對(duì)骨吸收影響占主要有關(guān)，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，對(duì)于佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠，南蛇藤單藥煎劑、斷藤益母湯、甲氨蝶呤均有明確的抗炎、抗骨質(zhì)破壞作用，三者作用比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。南蛇藤對(duì)于雌性AA大鼠CTX-Ⅰ的作用是雙向的，既因抗骨質(zhì)破壞作用降低CTX-Ⅰ濃度，也因卵巢毒性導(dǎo)致骨吸收升高CTX-Ⅰ濃度。加入川續(xù)斷、益母草組成復(fù)方后可降低南蛇藤副作用，但隨著南蛇藤劑量的提高，其降低南蛇藤副作用的效果消失。

作者：雷旭杰 張明英 郭麗 林昌松 單位：廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕病科 廣州市荔灣區(qū)第二人民醫(yī)院