靶向毒力發現和鑒定抗念珠菌病藥物范文

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摘要：白色念珠菌，屬于條件性致病真菌，是健康人群正常菌群的一種。目前在真菌病治療方面存在許多缺點比如醫療藥物數量抗真菌的藥物毒性的出現等。本文主要涵蓋關于白色念珠菌病過程，靶向致病過程的相關分子以及真菌毒力因子等研發新型抗真菌毒力物質的進展。由于白色念珠菌的致病性與絲狀化及生物膜的形成息息相關，因此，白色念珠菌絲狀化和生物膜形成過程也成為了本文闡述的兩大關鍵點。

關鍵詞：抗真菌；生物膜；白色念珠菌；絲靶向毒力；毒力因子；耐藥性

1前言

白色念珠菌是念珠菌病中最常見的致病菌，它可以存在于正常人體中，在正常情況下，早到新生兒時期就以共生體的形式寄生于人體尤其是皮膚、胃腸道(包括口腔)、生殖泌尿道的黏膜表面，一般對人體只有少量甚至不會造成傷害。但是，當機體免疫功能破壞，菌群失調或器官移植、或經污染的器械手術等，會造成各種各樣的感染，輕者發生淺表真菌感染，嚴重者致深部真菌感染甚至會威脅生命。目前的抗真菌類藥物嚴重匱乏且受到嚴重的宿主毒性和耐藥性的限制。由于真菌細胞和人類細胞具有類似的生物學機制，很難找到合適的靶點，因此限制研發新藥的進程。與靶向真菌細胞生長過程相比，靶向毒力方式無疑是研發新型抗真菌藥物更好的選擇。在白色念珠菌中，絲狀化和生物膜的形成被認為是兩種主要的毒力因子，與念珠菌病的發病機制具有密切的聯系。新型抗真菌類物質的成功開發要求科研工作者和臨床醫生、資金供給者和政府機構以及生物技術和藥物公司之間的協調合作。

2念珠菌和念珠菌病

能夠導致念珠菌病的因素非常多，包括免疫抑制劑的使用、廣譜的抗生素廣泛使用、移植、醫療器械相關介入手術、腸外營養、出生時極低的體重、年齡以及艾滋病感染、糖尿病、藥物濫用等等。例如，患口咽念珠菌病者最常見的是艾滋病患者，同時，頭頸部腫瘤患者持續注射抗生素和皮質激素等免疫抑制劑也頻發此病。另外女性陰道念珠菌病(亦稱復發性念珠菌陰道炎)也侵襲著大量分娩期的婦女。在美國，系統性念珠菌病的發生率在10萬人中，就有約20例(或每年約6萬例)，而在高危病人中可以增加到50例。數據顯示，僅在過去二十年里，這個數據增加了20倍，而感染者的死亡率在30%~50%之間。

3抗真菌類藥物治療及其耐藥性

新型抗真菌類藥物的研發極具挑戰，因為真菌細胞與人類宿主細胞具有類似的真核生物機制，因此要在真菌細胞內找到一種具有選擇性的且對某種真菌具有特異性的靶點是非常困難的，而這恰恰是研發抗真菌類藥物所必須的條件。這也是目前一些抗真菌藥物具有嚴重宿主毒性的原因。嚴格地從臨床角度上來講，目前可用于對抗念珠菌的抗真菌類物質只有三種：多烯類、唑類、棘白菌素類。例如，兩性霉素B，一種作用于麥角固醇的廣譜多烯類，可破壞膜的完整性。自從19世紀50年代引入后的數十年間，它就一直是抗真菌類治療的“金標準”，但它的應用被它固有的毒性尤其是腎毒性所限制。唑類，具體來說是三唑類(例如，氟康唑)，這類抗真菌類藥物研發于19世紀八九十年代，它可以抑制麥角固醇的合成，然而，一個更大的問題出現了，那就是耐藥性(包括對各種各樣唑類衍生物的交叉耐藥性)。耐藥性，大部分是通過靶點酶(羊毛甾醇脫甲基酶)的點突變或者藥物外排泵的過表達引起的。同時，跟念珠菌病有很大關聯的生物膜的形成會使唑類藥物失效，因為在生物膜庇護下的細胞會表現出極強的對唑類抗真菌物質的耐藥性（高1000倍）。后來一種新型抗真菌物質也隨之研發上市，那就是棘白菌素(例如，卡泊芬凈)。這種半合成的脂肽類抗生素可抑制β-1,3-D葡聚糖的合成，而這正是真菌細胞壁的關鍵組成物質，這是第一種作用于真菌的某一組織而不是哺乳類(也就是宿主)細胞的抗真菌類藥物。它們由于自身出色的安全性，因而被加入到抗真菌類物質庫后受到極大的歡迎，但是抗藥性的出現(主要是因為編碼靶點酶FKS1基因的突變)逐漸成為一個亟待解決的問題。另外，遺憾的是，棘白菌素類藥物只能通過靜脈注射的方式給藥，故通常它僅限于治療嚴重的念珠菌病。

4靶向毒力：

抗真菌藥物發展中未被利用的新領域傳統的抗生素通過殺死細胞或者抑制其生長的方式來達到殺菌目的。這些作用機制具有高度的選擇壓力并最終導致抗真菌藥物耐藥性的出現。自從青霉素引入臨床治療后，幾乎每一種臨床使用的抗生素都具有了耐藥性，故而研發新型抗生素十分重要。得益于我們人類對微生物發病機制的逐漸了解，一種新型的替代方法誕生了，那就是靶向真菌感染所必需的因素，對宿主造成傷害所需的毒力因子。毒力的定義是指病原體造成明顯病癥的能力，毒力因子是指能夠對宿主的組織器官造成傷害的微生物因子或者過程。靶向毒力主要的優點有：①有利于增加新型抗真菌化合物研發的潛在靶點；②能夠保護宿主微生物群；③藥物選擇性壓力低，能夠延緩或避免抗生素耐藥性的發展。值得考慮的是，各病原體之間的毒力經常是特異的，因此抗毒力藥物通常情況下的抗菌譜較窄。在使用抗毒力因子藥物之前必須要經精確、快速的診斷，在未經快速精確診斷的情況下使用可能會使念珠菌病情惡化。

5絲狀化和生物膜形成是白念珠菌的重要毒力因子，是開發新型抗真菌藥物的重要靶標

白色念珠菌作為一種條件性致病菌，其致病性與本身固有的毒力屬性和宿主免疫力相關，人們認為白色念珠菌的毒性與胞外水解酶、表型轉化、抗原變異性以及分子擬態的產生與發生有關。絲狀化和形成生物膜的能力被認為是引起念珠菌病的主要毒力因子。因此，接下來本文將著重論述這兩者的生物過程在白色念珠菌感染當中扮演的角色，為靶向此兩者研發新型抗治療念珠菌藥物提供依據。

5.1新型抗真菌藥物的研發：

靶向白色念珠菌的絲狀化白色念珠菌是一種多形態的真菌，并且可以在酵母和絲狀形態進行可逆的形態轉變。酵母細胞可誘導形成真菌絲，菌絲在根尖連續延伸后隔斷生長，而假菌絲則以單極芽的形式生長，芽發育成伸長的細胞，并始終與母細胞相連(圖1)。絲狀本身代表著毒力的性狀，同時它還和其它與細胞形態有關的毒力因子之間存在相互調節的作用。形態轉變是應對外界刺激的正常反應，包括體溫(37℃)、血清、中性pH、氨基酸、營養物質(例如N-乙酰葡萄糖胺)、微量需氧環境以及特殊的人體激素。從目前的研究來看，這顯然是一個復雜而高度精確的過程，因為信號通路可能依賴于單獨的或相同的轉錄因子，而轉錄因子可能會聚合在共同的靶基因上，從而觸發特異性基因的表達。絲狀化受正負兩方面的調節，白色念珠菌的關鍵基因與絲狀化的正調節有關，包括CPH1、EFG1、HGC1和UME6，這些基因由多種宿主環境信號誘導參與菌絲的延伸。絲狀化的負調節主要依靠白色念珠菌的通用阻遏分子，TUP1。此外，含有鋅指結構域的DNA結合蛋白CaNr1p可以與Tup1p一起作為絲狀化的負調節因子。這些可逆性的形態轉變有助于疾病的建立和發展。雖然酵母細胞能有效地散布到全身，但絲狀形態的細胞更容易穿透和破壞組織，最終導致宿主死亡。早期的實驗證明了絲狀化在白色念珠菌毒力中的主要作用：△efg1或△efg1/△cph1基因突變菌株不能形成絲狀體，并且在散播性念珠菌病的小鼠模型中表現出毒力減弱。在這些菌株中，形態轉變可以很容易在動物體內實現，使用白色念珠菌tet-UME6和tet-NRG1菌株，既證明了與絲狀化增加有關的毒力增加，也證明了當感染組織中破壞菌株絲狀形成時其死亡率降低(100%存活)。這些研究結果表明抑制絲狀化形成是研發新型抗真菌藥物的有效靶點。大量的小分子化合物參與調節形態轉換，抑制絲狀化，調控白色念珠菌由酵母形態向菌絲形態轉變。這些化合物包括細菌和真菌調控因子(如銅綠假單胞菌中的吩嗪化合物和高絲氨酸內酯、變形鏈球菌中的突變抗菌素和由釀酒酵母分泌的癸酸)，由白色念珠菌自身產生的群體感應分子法尼醇和其他自調節醇。Johnson課題組鑒定了多達21種不同的白色念珠菌絲狀化抑制劑，并隨后證明其中一些抑制劑通過不同信號轉導途徑發揮作用。需要注意的是，大部分的研究都是在體外進行的，目前仍缺乏證據證明這些化合物在體內的作用。此外這些化合物作為抗真菌藥物的藥理活性以及毒副作用尚不清楚。在少數情況下，一些化合物在體內進行了測試，迄今為止大多測試或效果頗微，或各種研究結果相矛盾。例如，外源性使用法尼醇，此藥在體外可阻止白色念珠菌酵母轉化為菌絲，而在感染念珠菌病的小鼠模型中卻出乎意料地增加了毒性；另一方面，小鼠腹腔注射模擬白色念珠菌培養上清液中醇成分的雞尾酒溶液(含法尼醇)顯示，在類似的念珠菌病感染模型中，小鼠存活率增加，器官中損傷減少。抑制白色念珠菌絲狀化的另一個優點是調節宿主免疫反應，這對解決感染至關重要。免疫系統的不同細胞(尤其是樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞)和上皮細胞，它們以不同的方式感知酵母和絲狀細胞，導致誘導了不同的先天性和適應性免疫反應。一般來說，如果暴露的是酵母菌形態的細胞，會產生保護性免疫反應，反之如果是絲狀形態的細胞，則會產生非保護性免疫反應，甚至直接致病，例如，黏膜上皮細胞能夠區分酵母菌和絲狀形態的細胞，而炎癥反應的加劇與白色念珠菌絲狀形成有關，從而導致陰道和口腔念珠菌病的發生。全身層面上而言，絲狀化對逃避吞噬細胞和機體免疫來說至關重要，從而觸發急性期反應，這將導致對宿主有害的過度炎癥反應。因此，抗絲狀化合物治療，可通過調節免疫反應對宿主產生有益的影響。事實上，從免疫學的角度來看，使用抗毒化合物治療效果，與使用減毒活疫苗時觀察到的情況是非常相似的。

5.2抗真菌藥物的開發：

靶向白色念珠菌生物膜形成許多微生物在它們的自然棲息地中是附著在膜表面，而非自由漂浮的，因此生物膜成為了現代微生物學發展的典范之一。生物膜是指附著于有生命或無生命物體表面被細菌胞外大分子包裹的有組織的細菌群體。生物膜細菌對抗生素和宿主免疫防御機制的抗性很強。真菌在感染部位可通過形成生物膜為自身提供安全的庇護所來延長感染時間，從而侵入新的感染位點，并抵制宿主的清除作用。據估計，有60~80%的人類感染都與生物膜形成有關。白色念珠菌是最常見的與生物膜形成有關的真菌，而實際上，在過去幾十年里，念珠菌病感染率增加與各種醫療植入設備(如支架、分流器、假肢、植入物、氣管內導管、起搏器以及各類導管)的使用率增加幾乎是持平的，并且主要集中在自身免疫防御能力受損人群。值得一提的是，酵母(主要是白色念珠菌)是導致導液管相關感染的第三大病菌，導液管相關念珠菌病的研究明確表明，血管導管的保留與真菌血癥的延長、抗真菌治療的高失敗率、轉移并發癥風險增加及死亡有關，其他癥狀諸如口咽念珠菌病、義齒性口炎，甚至陰道念珠菌病，也與白色念珠菌有關。從臨床的角度來看，白色念珠菌生物膜最顯著的特點是對傳統抗真菌治療具有較高的耐藥性。一些研究已經明確地證明，念珠菌生物膜導致對它大多數臨床使用的抗真菌藥物，特別是唑類和多烯類藥物的抗藥性顯著增加，其結果是念珠菌生物膜對這些病人的健康造成不利影響。白色念珠菌生物膜的形成是一個動態復雜的多級過程，這包括最初的細胞黏附，緊接著細胞分裂、增殖及生物膜成熟，產生細胞外基質。此后，細胞從生物膜中分離出來，這代表著分離的微生物將返回最初浮游的生長模式，從而附著在新的表面，完成生物膜的整個生命周期。絲狀化及細胞與細胞之間的信息交流(即群體感應)在白念珠菌生物膜的形成過程中起著極其關鍵的作用，與絲狀化相似，生物膜的生長是對不同環境的不同反應，并在分子水平上受復雜的調控網絡控制。目前在醫學和經濟上對新型抗生物膜相關感染和治療策略的迫切需求，主要表現在預防性(即抑制生物膜形成)和治療性(即針對已經形成的生物膜)兩方面，而這些策略不僅可能與抑制白色念珠菌生物膜生長的生物材料、導管涂層及鎖定液(即在導管內局部使用極高濃度的抗真菌藥物)，還會發現能對抗生物膜內細胞的新型活性分子。該領域的研究十分活躍，通過各種天然產物抗生物膜活性的檢測以及不同藥物庫中小分子化合物的篩選，檢測到一些活性化合物，包括鈣調神經磷酸酶抑制劑(如環孢菌素A，FK506)和hsp90抑制劑(如格爾德霉素)具有抗生物膜活性，且與唑類聯用對抑制白色念珠菌生物膜的形成表現出協同作用，增強了棘白菌素對煙曲霉的活性。另外，研究表明脫氧核糖核酸酶可部分提高抗真菌藥物的抗生物膜活性。另一種可能的途徑是在導管相關的生物膜感染的情況下，靶向細胞的散播，因為分布在生物膜上的細胞負責位于末梢的深層次念珠菌病的散播、滲入以及建立。值得注意的是，由于絲狀體和生物膜之間的密切聯系，調節白色念珠菌形態轉變的藥物也有抑制生物膜發育的可能性。抗真菌藥新型抗生素研發的主要瓶頸之一是，傳統的微生物培養技術與現代新藥研發(高通量藥物篩選，HTS)及其“求速”為主導的理念相矛盾。因此，為了克服這一障礙，Srinivasan等人近期提出一種基于高通量微陣列的白色念珠菌生物膜技術，其成果為一種名為CaBChip的芯片(白色念珠菌生物膜片)。該芯片由768個空間上不同的納米生物膜組成，將其放置在標準顯微鏡載玻片上后測得每層生物膜的體積約為50nL。盡管其微型化程度接近2000倍，但CaBChip芯片上的納米生物膜表現出的表型特征(即形態和結構特征以及增加的耐藥性)能與傳統的96孔微量滴定板模型形成的生物膜相當。該納米生物膜芯片具有快速、強大的處理能力，易于自動化，并且與標準微陣列技術和設備完全兼容。此外，它還減少了體力勞動，減少了試劑的使用，大大降低了實驗成本。因此，這種白色念珠菌生物膜技術，真正意義上能做到HTS可用于新型抗生物膜藥物研發上，能夠迅速、簡便、廉價且能同時篩選千百種化合物，加速抗真菌藥物研發進程。

6展望

靶向毒力是研發新型抗真菌藥物極佳的替代選擇，它具有全新的作用機制，單獨用藥，也能夠與抗真菌藥物聯合用藥。靶向絲狀化和生物膜形成是研發治療念珠菌病的新型抗毒力方法。雖然在分子層面上人們不斷加深對白色念珠菌的認知，仍然是一項十分困難的任務。與殺死病原體或阻遏其生長相比，靶向與感染發病機制相關的毒力是開發新型抗真菌藥物的另一種極具研究前途并且更有效的途徑。對于念珠菌病尤其是白色念珠菌而言，應通過增加對其致病機理了解來促進這一工作。在過去的十年里，白色念珠菌基因組測序項目的完成以及進入到后基因組時代，徹底改變了微生物的基礎生物學研究。從比較基因組學和功能基因組學及大規模突變體的產生，到蛋白質組學，以及全新的、有效的分子方法分析白色念珠菌的生物學性質和致病性，念珠菌病進入了“分子生物學的爆發”的時代。與此同時，念珠菌病的感染率、發病率和死亡率持續上升。因此，在念珠菌病研究中，新型抗真菌藥物的研發仍是一項極具挑戰的工作。事實上在近幾十年來，唯一一種新型抗真菌藥物是棘白菌素，它是制藥公司用傳統篩選方法從土壤微生物中篩選出的天然產物。由于絲狀化和生物膜形成與念珠菌病的發病機制有著不可分割的聯系以及靶向這兩個過程使新藥具有良好的前景。這是兩個非常活躍的研究領域，全球有數百個小組在研究這些生物過程。希望通過努力能在不久的將來研發出新型抗真菌藥物以增加或補充當前的抗真菌藥物庫。

作者：詹洪洪 單位：西南大學藥學院