盤龍參種子快繁技術研究范文

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摘要：以盤龍參蒴果為外植體，進行組織培養快繁試驗，采用對比試驗研究不同基本培養基、激素濃度的配比、天然添加物對盤龍參種子萌發、原球莖增殖、分化的影響，從中篩選出離體條件下適宜種子萌發、種苗快繁的培養基配方。結果表明，外植體最佳消毒方案是采用75%乙醇浸泡30s結合0.1%HgCl2浸泡20min。最適合的種子萌發誘導培養基為1/2MS+NAA0.5mg/L+瓊脂4.0g/L+蔗糖3%+馬鈴薯汁15%；原球莖在1/2MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L+瓊脂4.0g/L+蔗糖3%+馬鈴薯汁15%的增殖效果最好，增殖率為380%；最適合盤龍參原球莖分化的培養基為1/2MS+NAA0.5mg/L+瓊脂4.0g/L+蔗糖3%+馬鈴薯汁20%。

關鍵詞：盤龍參；種子；原球莖增殖；組培

快繁體系盤龍參（Spiranthessinensis），又名綬草、龍纏柱，是蘭科綬草屬多年生陸生蘭類，全世界共50種，我國僅有1種，生于海拔200～3400m的山坡林下、灌叢下、草地或河灘沼澤草甸中[1]。據民間草藥記載，盤龍參其根或全草入藥，用于病后氣血兩虛、少氣無力、氣虛白帶、遺精、失眠、燥咳、咽喉腫痛、纏腰火丹、腎虛、肺癆咯血、消渴、小兒暑熱癥；外用于毒蛇咬傷、瘡腫等[2]。現代藥理研究表明，盤龍參含有二氫菲類、黃酮類、苯丙素類、阿魏酸二十醇酯、甾醇等多種藥理活性成分，具有明顯的抗病毒、抗腫瘤作用[3]。盤龍參除藥用外，因其花序有如紅龍或青龍般盤繞在花莖上，花形別致奇特，美麗玲瓏，可用于園林布景或作為袖珍盆景近距離觀賞，是極具藥用、觀賞價值的經濟植物。近年來人們對盤龍參過度采挖，使得其野生資源數量迅速下降，已被《野生植物保護名錄》列為國家二級保護植物、國際瀕危植物[4]。由于盤龍參種子微小，自然萌發率和繁殖率極低，人工栽培比較困難，目前關于盤龍參組織培養的報道較少，牛玉璐等[5]以盤龍參肉質根、幼葉、花序軸為外植體，比較發現花序軸是比較理想的外植體，誘導率達83%。李家敏[6]和宋洪文[7]均做了外植體消毒滅菌試驗，李家敏以花梗頂端5cm為外植體，認為75%酒精浸30s的處理效果好，宋洪文以花梗腋芽為外植體，認為外植體用75%酒精浸8s，0.1%升汞消毒8min效果最好。丁蘭等[8]以種子為外植體，結果表明種子誘導萌發形成種苗的僅3%，盤龍參種子在無植物生長物質的培養基中能夠萌發，但不能發育成苗；在含有1.0mg/LKT、0.1mg/LIAA和0.1mg/LGA3的培養基中萌發，并能進一步發育形成種苗；在較高濃度生長素（1.2mg/LNAA）的培養基中不能萌發；種苗在較高濃度細胞分裂素（12.0mg/L）和較低濃度生長素（0.1mg/L）配比的培養基中能夠增殖，最高增殖系數可達到2.8。為提高盤龍參種子萌發率和原球莖增殖率，本文作者以四川省樂山市采集的盤龍參種子為外植體，擬通過正交設計的方法研究幾種因素對其種子組培快繁的影響，建立人工快繁技術體系，為保護、開發和利用盤龍參資源提供具有實用價值的資料。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料為盤龍參成熟蒴果內種子，采自四川省樂山市。

1.2試驗方法

1.2.1培養基配制采用1/2MS：主要是大量元素和微量元素減半，鐵鹽、有機物不變；馬鈴薯提取液（potatoextract,PE）：稱取定量的馬鈴薯加適量水用家用攪拌機打成漿，和煮化的瓊脂蔗糖共同加熱后加入配制好的基本培養基，定容分裝后高壓滅菌；香蕉提取液（bamanaextract,BE）：熟香蕉去皮后加適量水用家用攪拌機打成漿，和煮化的瓊脂蔗糖共同加熱后加入配制好的基本培養基，定容分裝后高壓滅菌。蘋果汁（appleextract，AE）：蘋果去皮后加適量水用家用攪拌機打成漿，和煮化的瓊脂蔗糖共同加熱后加入配制好的基本培養基，定容分裝后高壓滅菌。

1.2.2外植體消毒5月間采集成熟、未開裂的盤龍參蒴果，刮除表面微絨毛，在流水下沖洗2h后用無菌水沖洗3遍；然后在無菌條件下取出，用質量濃度為75%的酒精消毒30s，0.1%HgCl2浸泡（處理時間10min、15min、20min、25min、30min、35min），共6個處理。浸泡消毒過程中輕微振蕩，以提高消毒效果，浸泡處理后，用無菌水洗5次。將蒴果表面的水分用無菌吸水紙吸干，放入無菌平皿中備用。用無菌鑷子挑開果莢，均勻撒播于1/2MS培養基上，每個處理接15瓶。統計14d內的污染率和萌發瓶數。

1.2.3種子萌發誘導培養基篩選試驗在無菌培養皿上用無菌鑷子挑開果莢，夾著開裂的果莢靠培養瓶口內側邊緣輕輕敲擊，讓盤龍參種子均勻散落，種子萌發以1/2MS為基本培養基，選用激素NAA、6-BA和添加物馬鈴薯汁、香蕉汁作4因子3水平正交試驗，共9個處理，每處理組接種5瓶。所有培養基中均添加30.0g/L蔗糖和4.0g/L瓊脂粉，調pH值至5.6～5.8，光照時間為12h/d，光照強度2000～2500lx，培養溫度24℃～26℃（下同）。培養60～70d后統計每瓶種子的萌發率，篩選合適的種子誘導培養基。

1.2.4原球莖增殖試驗種子在萌發培養基上誘導產生的原球莖轉接到含NAA與6-BA不同組合的1/2MS+3%蔗糖+15%馬鈴薯汁+4.0g/L瓊脂粉的培養基上，pH值5.8，60d后根據原球莖的增殖率=（原球莖總數－接種數）/接種數，先篩選出最佳激素組合的培養基，再添加不同的有機物添加劑如香蕉汁（BE）、蘋果汁（AE）、馬鈴薯提取液（PE），各處理設三個重復，每個重復接種15瓶，每瓶接10個原球莖。根據原球莖的增殖率最終確定原球莖增殖的最佳培養基。

1.2.5原球莖分化一次成苗試驗以基本培養基（1/2MS、2/3MS、MS）、NAA（0、0.5mg/L、1.0mg/L）、6-BA（0、0.5mg/L、1.0mg/L）和馬鈴薯提取液（10%、15%、20%）作4因子3水平正交試驗，共9個處理，所有培養基中均添加30.0g/L蔗糖和4.0g/L瓊脂粉，pH值5.8。每種組合培養基接20瓶，每瓶接20個原球莖，60d后測定原球莖的分化系數（分化產生芽總數/原球莖總數）。根據分化系數，并結合植株生長狀況篩選原球莖分化一次成苗培養基。

1.3數據處理

用DPS軟件對數據進行正交試驗和Duncan's新復極差檢驗分析。

2結果與分析

2.1不同滅菌方法對外植體污染率的影響

從外植體消毒時間看，盤龍參種子在0.1%的HgCl2中消毒30min內隨著消毒時間的延長污染率降低；消毒30min以上的效果最好，污染率為0%，但萌發瓶數太低；消毒20min，雖然污染率為20%，但萌發的瓶數最多；消毒時間超過30min無污染但同時種子不萌發。魯松[9]在金線蓮種子消毒試驗時發現種子在75%乙醇滅菌時間30s、45s、60s處理下污染率無顯著差異，酒精穿透力很強，時間過長會損傷外植體，一般酒精消毒不超過60s為宜。因此我們選擇在酒精中消毒30s作為前期的處理，找出種子在0.1%的HgCl2中消毒的最佳時間。外植體消毒不徹底易產生污染，消毒處理時間過長可使盤龍參蒴果因浸泡過度，消毒劑透過種皮毒害種子使種子出現死亡或進入永久休眠狀態。外植體消毒處理對盤龍參培養的影響：獲得無菌系是組培工作的基礎，野生盤龍參生長在陰暗潮濕的自然環境中，除了繁多的伴生真菌與細菌外，還有大量的內生菌，這些微生物不易清除，再加上盤龍參蒴果體積小給組培工作帶來極大的困難，本研究采用75%乙醇浸泡30s結合0.1%HgCl2浸泡20min，滅菌效果最好。

2.2植物生長物質對盤龍參種子萌發的影響

將成熟的盤龍參種子播種于萌發培養基上，成熟的盤龍參種子呈粉絲狀，黃褐色，60d后培養基上的種子開始萌發，可見白色原球莖（附圖）。由表2可見，盤龍參種子在本試驗設置的9個培養基配方中均能萌發并發育成苗，香蕉汁對種子萌發的極差最大，是影響盤龍參種子萌發的關鍵因子，隨著香蕉汁濃度的提高，種子萌發率降低；培養基中添加一定濃度的NAA可以促進種子萌發，高濃度6-BA不利于種子萌發，其中不加6-BA的萌發率高；添加馬鈴薯汁的培養基種子萌發時間早，且原球莖較大，萌發率高。根據各試驗因子1、2、3水平下的萌發率均值進行水平選優：NAA選第3水平，即0.5mg/L；6-BA選第1水平，即0mg/L；馬鈴薯汁選第2水平，即15%；香蕉汁選第1水平，即0%。因此，最適合盤龍參種子萌發的培養基為1/2MS+NAA0.5mg/L+瓊脂4.0g/L+蔗糖3%+馬鈴薯汁15%。

2.3不同激素組合及不同天然附加物對原球莖增殖的影響

以1/2MS+15%馬鈴薯汁+3%蔗糖為培養基。不同濃度NAA和6-BA對原球莖的增殖均有促進作用，不同激素組合差異極顯著，其中以NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L的增殖效果最好，增殖率為380%。以1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖3%為培養基，添加不同的天然有機物對盤龍參原球莖增殖的影響試驗結果見表4。原球莖接種14d后，原球體表面會產生一些新生的小原球體，呈黃綠色，整齊，部分分化成具有一片小葉的幼苗,在培養基中加入一定量的馬鈴薯汁后能有效地抑制原球莖褐化，而且能大大增加原球莖的增殖率，且原球莖比蘋果汁和香蕉汁的更健壯。3種天然附加物對原球莖增殖的影響差異極顯著,以15%馬鈴薯汁對盤龍參原球莖的增殖促進作用最大，增殖率達380%，極顯著高于15%蘋果汁和15%香蕉汁，而香蕉汁的效果則差，增殖率為16%，呈黃白色，生長不良。綜上所述,盤龍參原球莖增殖的最適培養基為1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+馬鈴薯汁15%+蔗糖3%，pH值5.8。

2.4不同培養基對盤龍參原球莖分化成苗的影響

在9個培養基組合中盤龍參原球莖分化均能不同程度分化成苗，6-BA對原球莖分化的極差值最大，是影響盤龍參分化的關鍵因子，隨著6-BA濃度的提高，原球莖分化系數降低，以不加6-BA的分化系數最高；培養基中添加一定濃度的NAA可以促進原球莖分化，但濃度超過0.5mg/L不利于原球莖的分化；馬鈴薯提取液也可促進原球莖分化，隨著其濃度的提高分化系數也提高。根據各試驗因子1、2、3水平下的萌發率均值進行水平選優：基本培養基選第3水平，即1/2MS；NAA選第2水平，即0.5mg/L；6-BA選第1水平，即0mg/L；馬鈴薯選第3水平，即20%。因此，最適合盤龍參原球莖分化的培養基為1/2MS+NAA0.5mg/L+瓊脂4.0g/L+蔗糖3%+馬鈴薯汁20%。隨著培養時間延長，分化的幼苗不斷生長，會出現新的莖段及新葉，在靠近根部的莖節基部處，會長出不定根，形成一完整的植株，4個月后會形成具有多個葉片、有2～3個側根、株高5～6cm的健壯植株。

3討論與結論

3.1植物生長調節劑對盤龍參組培苗增殖生長的影響

本試驗采用了NAA和6-BA兩種植物生長調節劑，添加一定濃度的NAA可以促進種子萌發，高濃度6-BA不利于種子萌發，其中不加6-BA的萌發率高；不同濃度NAA和6-BA組合對原球莖的增殖均有促進作用，差異極顯著，其中以NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L的增殖效果最好，增殖率為380%。6-BA對原球莖分化的極差值最大，是影響盤龍參分化的關鍵因子，隨著6-BA濃度的提高，原球莖分化系數降低，以不加6-BA的分化系數最高；培養基中添加一定濃度的NAA可以促進原球莖分化，但濃度不宜超過0.5mg/L。

3.2有機添加物對盤龍參組培的影響

天然添加物在蘭科植物組培中較為常用，在本試驗中天然添加物對種子萌發和原球莖增殖起到關鍵的作用，添加馬鈴薯汁的培養基種子萌發時間早，且原球莖較大，萌發率高；在培養基中加入一定量的馬鈴薯汁能有效地抑制原球莖褐化，天然附加物對原球莖增殖的影響差異極顯著，以15%馬鈴薯汁對盤龍參原球莖的增殖促進作用最大，增殖率達380%，極顯著高于15%蘋果汁和15%香蕉汁，而香蕉汁的效果則差，增殖率為16%，呈黃白色，生長不良。本試驗以成熟種子為外植體，分別研究了不同基本培養基、激素配比、天然添加物對鐵盤龍參種子萌發、原球莖增殖、分化成苗的影響，初步建立了一套比較完整的盤龍參快繁體系。結果表明，種子萌發適宜的培養基配方為1/2MS+NAA0.5mg/L+瓊脂4.0g/L+蔗糖3%+馬鈴薯汁15%；原球莖在1/2MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L+瓊脂4.0g/L+蔗糖3%+馬鈴薯汁15%的增殖效果最好，增殖率為380%；最適合盤龍參原球莖分化的培養基為1/2MS+NAA0.5mg/L+瓊脂4.0g/L+蔗糖3%+馬鈴薯汁20%。綜合來看，通過本試驗，種子的萌發率有所提高，但仍然不理想，低于10%，明顯低于同是蘭科的鐵皮石斛和金線蓮（達90%以上）。可能是種子的成熟度還不夠，使得萌發率受到很大的影響，下一步我們將對組培快繁的各個環節做進一步優化，以提高繁殖系數和質量，為提供適合移栽的組培苗還要進行促壯促根培養。

參考文獻

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會．中國植物志[M].北京:科學出版社，1999:227－231．

[2]國家醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草[M].上海:上海科學技術出版社，1999.

作者：鐘愛清 單位：福建省寧德市農業科學研究所