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《國際檢驗醫(yī)學雜志》2014年第十二期
1資料與方法
1．1一般資料實驗菌株：大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、陰溝腸桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、屎腸球菌、糞腸球菌，共14種細菌；白色念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌，共4種真菌。所有實驗菌株均按要求分離純化，并經(jīng)西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科微生物實驗室VITEKCompact全自動細菌鑒定藥敏分析儀鑒定。標本來源：從西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院中心ICU、RCU、肝膽外科、胸外科、腎內(nèi)科、腫瘤外科等多個科室收集90例臨床疑似真菌感染患者的穿刺引流液標本，另采集健康人全血標本2mL，提取人類基因組DNA。
1．2方法
1．2．1標本的采集在嚴格無菌操作下，用一次性無菌注射器穿刺患部，抽取引流液10mL，將2mL注入EDTA－K2抗凝管，剩余8mL注入血培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。靜脈穿刺采集健康人外周血2mL，注入EDTA－K2抗凝管。抗凝標本放入4℃冰箱中暫存。
1．2．2標本預處理將抗凝管中的引流液標本顛倒混勻，取1mL放入2mL滅菌EP管中，加入1mL10mmol／LTris－HCl（pH8．0）充分顛倒混勻，14000r／min離心5min，棄上清液，沉淀物于－40℃冷凍保存，以備提取DNA之用。
1．2．3標本中真菌基因組DNA的提取用100μL10mmol／LTris－HCl（pH8．0）緩沖液重懸經(jīng)預處理的標本，加入20μL溶壁酶（10U／μL），用加樣器吸打混勻，37℃水浴30min后應用QIAampBloodDNAMiniKit（QIAGEN，Cat．No．51106）提取，操作步驟按照試劑盒說明書。
1．2．4檢測真菌通用引物PCR的特異性實驗所用真菌通用引物參照Lott等［8］設(shè)計ITS1（F）：3′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－5′；ITS3（F）：3′－GCATCGATGAAGAACGCAGC－5′；ITS4（R）：3′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－5′。25μLPCR反應體系包括：10×Buffer2．5μL，MgCl2（25mmol／L）2．0μL，dNTP（2．5mmol／L）2．0μL，上游引物（5μmol／L）0．5μL，下游引物（5μmol／L）0．5μL，Taq酶（5U／μL）0．15μL，模板DNA2μL，滅菌超純水15．35μL。PCR反應條件：預變性94℃5min；變性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃40s，共35個循環(huán)；最后延伸72℃7min。PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳電壓為6V／cm，電泳時間為1h，采用溴化乙錠（EB）染色20min，在凝膠成像分析系統(tǒng)拍照保存。
1．2．5制備梯度菌懸液為了檢測真菌通用引物PCR的敏感度，本研究用1麥氏單位（約3×108CFU／mL）的白色念珠菌菌液100μL加入200μL純水，得到約108CFU／mL的菌液，然后進行1∶10倍比稀釋，取107、108、1093個稀釋度的菌液涂布沙保羅平板，每個稀釋度3個平板，每個平板涂100μL，37℃培養(yǎng)48h后計數(shù)菌落，選用3個平板的平均菌落數(shù)作為參考菌數(shù)。提取真菌DNA、PCR反應體系及條件同上。
1．2．6真菌通用引物PCR產(chǎn)物的測序應用QIAquickPCRPurificationKit純化PCR產(chǎn)物。20μL測序PCR反應體系包括：滅菌去離子水13．5μL，5×BigDyeSeqBuffer3．5μL，2．5×BigDye1μL，測序引物ITS4（3．2pmol／μL）1μL，純化的PCR產(chǎn)物1μL。反應條件：預變性96℃1min；變性96℃10s，退火50℃5s，延伸60℃4min，共25個循環(huán)。測序產(chǎn)物按EdgeBio試劑盒純化，然后在PCR儀上變性，條件為：95℃4min，4℃4min。用ABI3500xl基因分析儀進行測序。
1．2．7測序結(jié)果的比對登陸http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／blast／Blast．cgi，將測序結(jié)果與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對。
1．3統(tǒng)計學處理應用SPSS17．0進行數(shù)據(jù)分析，采用配對四格表資料的χ2檢驗對培養(yǎng)法和測序法的陽性率進行比較，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。
2結(jié)果
2．1真菌通用引物PCR特異性4種真菌的DNA經(jīng)引物ITS1／ITS4和ITS3／ITS4擴增后均產(chǎn)生單一條帶，經(jīng)與DNA標記物（100bpDNALadder）比對，產(chǎn)物大小和預期相符，而14種細菌及人類基因組DNA經(jīng)PCR后無任何條帶，見圖。
2．2真菌通用引物PCR敏感性引物ITS1／ITS4最低檢測限為103CFU／mL，ITS3／ITS4最低檢測限為102CFU／mL，見圖3～4。
2．3真菌通用引物PCR檢測臨床標本見圖5～6。
2．4測序結(jié)果11株P(guān)CR陽性臨床標本經(jīng)測序均得到較好的序列，與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對后均可將病原性真菌鑒定到種的水平。
2．5測序法與培養(yǎng)法檢測陽性率比較90例穿刺引流液中，培養(yǎng)法檢出4例陽性標本（3例白色念珠菌和1例光滑念珠菌），這4例標本經(jīng)測序法檢測也均為陽性；86例培養(yǎng)法檢測的陰性標本中有7例標本為測序法檢測陽性（5例白色念珠菌、1例光滑念珠菌、1例熱帶念珠菌）。測序法陽性率是12．22％（11／90），培養(yǎng)法陽性率是4．44％（4／90），測序法陽性率是培養(yǎng)法的2．75倍，二者差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝5．14，P＜0．05）。見表1。
3討論
真菌感染的發(fā)病率逐年增加，尤其對于急性播散性念珠菌感染，早期快速地檢測和鑒定對選擇抗真菌藥物非常重要［4］，而傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的敏感性低且耗時長，這給檢測手段提出了新的要求，因此尋找一種快速的檢測和鑒定真菌感染的方法勢在必行。測序法以其高敏感性和特異性，而成為一種極具前景的真菌感染檢測方法。在病原學診斷中，its區(qū)被越來越廣泛地應用于菌種鑒定［11］。但是，目前并沒有一個真正意義上的真菌通用引物。因此，本研究首先驗證了所用引物的特異性，結(jié)果表明這2對引物可以用于擴增臨床上常見的病原真菌，且不會將細菌及人類的DNA擴增出來。為了排除假陽性、最大限度地篩檢病原菌，并保證片段長度能夠在種的水平對常見真菌進行鑒定，本研究用了2對通用引物，其中ITS3／ITS4的擴增產(chǎn)物包括：5．8SrDNA的3′端、ITS2區(qū)、28SrDNA的5′端；ITS1／ITS4的擴增產(chǎn)物包括：18SrDNA的3′端、ITS1區(qū)、5．8SrDNA、ITS2區(qū)、28SrDNA的5′端。研究結(jié)果表明，引物ITS3／ITS4最低檢測限為102CFU／mL，引物ITS1／ITS4最低檢測限為10CFU／mL，且對同一標本，二者測序比對結(jié)果一致。
測序法具有較高的檢測敏感性和特異性，可以在少量的臨床標本中檢測到真菌，并可以將檢測時限縮短至6～8h，而臨床上傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)表型鑒定方法一般需2～3d的時間才能得到結(jié)果，且有的真菌難以培養(yǎng)鑒定。另外，表型鑒定方法數(shù)據(jù)庫中的信息也是有限的，而絕大多數(shù)真菌的基因已被測序完成，數(shù)據(jù)庫十分完善，為真菌PCR測序鑒定提供了充分的保障。真菌感染主要以念珠菌為主，尤以白色念珠菌所占比例最大。本研究結(jié)果表明穿刺引流液感染真菌均為念珠菌，主要以白色念珠菌為主，占72．7％（8／11）。
綜上所述，本研究通過應用2對真菌通用引物進行PCR測序來鑒定菌種，摸索出了一套切實可行的方法，較傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法快速，且特異性和敏感性更高。后期工作可進一步收集其他標本類型并僅采用敏感度更高的ITS3／ITS4作為通用引物進行檢測，進一步驗證該方法，使之成為一套成熟的、臨床實用性強的真菌檢測手段。
作者：黃君華張書婉張寧單位：西安醫(yī)學院醫(yī)學技術(shù)系西安市兒童醫(yī)院檢驗科西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科