消栓通絡片對大鼠腦缺血治療研究范文

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《安徽醫藥雜志》2016年第11期

摘要：

目的對比研究改工藝后消栓通絡片與市售消栓通絡片對大鼠局灶性腦缺血的治療作用差異。方法采用頸內動脈插入尼龍線栓的方法建立大鼠左側大腦中動脈栓塞模型。觀察給藥后各組大鼠行為學評分、測定腦梗死面積及血清超氧化物歧化酶（SOD）、NFκB、caspase3含量的差異。結果改工藝后的消栓通絡片高、中劑量組均能有效緩解4h，24h時MCAO引起的行為學病變，降低行為學評分；高、中、低劑量組均能升高MCAO引起的SOD降低；高、低劑量組能明顯降低MCAO引起的血清NFκB的升高；中、低劑量組對MCAO引起的Caspase3的顯著升高有一定抑制作用。與市售消栓通絡片比較，改工藝消栓通絡片從大鼠行為學評分的降低，血清SOD活性的增加，血清Caspase3、NFκB的表達效果均有優于市售消栓通絡片的趨勢。結論改工藝消栓通絡片各劑量組對腦缺血進展期大鼠均有一定的恢復作用，其藥效略優于市售消栓通絡片。

關鍵詞：

中藥工藝改進；黃芪；三七；槐花；丹參；缺氧缺血，腦；大鼠

消栓通絡片是治療中風恢復期的有效驗方，有活血化瘀，溫經通絡的作用。臨床常用于腦血栓引起的半身不遂，肢體麻木的治療。我們對該方的傳統制劑工藝進行了改進，將黃芪、三七、槐花、丹參四味藥材由原工藝的水提改為60％醇提。制劑改進后規格由原來的1．8g生藥／片可增加為2．5g生藥／片，服藥量將明顯減少，增加病患用藥依從性。本實驗采用MCAO法制作大鼠腦缺血再灌注模型對比觀察改工藝后消栓通絡片與市售消栓通絡片對大鼠局灶性腦缺血的治療作用差異及其作用機制。

1實驗材料

1．1藥物與試劑

1．1．1供試品

改工藝消栓通絡片浸膏粉由康緣現代中藥研究院提供，規格：12．27g生藥／g提取物，批號130926。供試品制備方法：將川芎、桂枝、木香、山楂、澤瀉、郁金六味藥材水煎，合并煎液，濾過、濃縮，加乙醇調至70％，靜置，取上清液濃縮、干燥。黃芪、三七、槐花、丹參四味藥材60％醇提，合并醇提液，濾過。大孔樹脂純化，濃縮，干燥。將兩次所得干浸膏粉碎，加入適量輔料，混勻，加入冰片，混勻，制成顆粒，干燥，壓制成片，包衣，制成2．5g生藥／片的藥物。

1．1．2對照藥

依達拉奉注射液：20mL：30g，2支裝，吉林省輝南長龍生化藥業股份有限公司，批號2013051002；消栓通絡片（市售）：1．8g生藥／片，某公司，批號：130301。

1．1．3試劑

水合氯醛，批號：20130426；羧甲基纖維素鈉，批號：20120330；磷酸氫二鈉，批號：20131125，均為國藥集團化學試劑有限公司試劑。氯化鈉，南京化學試劑有限公司，核因子κB放免藥盒，批號：20140401；活化半胱氨酸蛋白酶蛋白3放免試劑盒，批號：20140410；超氧化物歧化酶檢測試劑盒，批號：20140101，均為北京華英生物技術研究所試劑。

1．2主要儀器

電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；CENTRFUGE5840型冷凍離心機，Eppendorf；DKS26恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；DHG9076A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司。

1．3實驗動物

SD大鼠，雄性，體重280～330g，SPF（無特定病原體）級，上海西普爾－必凱實驗動物有限公司，許可證號碼：SCXK（滬）2013－0016。

2實驗方法

2．1動物分組

取體重280～330g的雄性大鼠，隨機分為7組。分組如下：假手術組（等容積5‰CMC－Na）、模型組（等容積5‰CMC－Na）、陽性藥依達拉奉組（1．13mg•kg－1大鼠）、市售消栓通絡片組（2．7g生藥•kg－1大鼠）、消栓通絡片高劑量組（0．44g提取物•kg－1大鼠）、消栓通絡片中劑量組（0．22g提取物•kg－1大鼠）、消栓通絡片低劑量組（0．11g提取物•kg－1大鼠）陽性藥腹腔注射給藥，1．13mg•kg－1大鼠，其它各給藥組大鼠于術前0．5h灌胃給藥1次，10mL•kg－1大鼠。1次／d，連續3日，假手術組、模型組給予等容積5‰CMC－Na溶液。

2．2造模方法

采用頸內動脈線栓法復制左側大腦中動脈栓塞（MCAO）模型。參照文獻方法加以改進［1］，分離出頸總動脈，繼續向下分離并結扎頸外動脈，分離出頸內動脈，在ECA距ICA2mm處剪一小口，將一尼龍栓子插入ECA并進入CCA，輕扎備線，防止出血。剪斷ECA，松開ICA的動脈夾，牽引ECA，使其進入ICA，繼續向下推進直至尼龍線插入深度約為18mm停止。此時松開CCA動脈夾，扎緊備線，外留1cm長線頭，縫合皮膚，回籠飼養。于缺血2h后再灌注，再灌注時輕拉尼龍線，使尼龍線拔出ICA，進入ECA殘端，血流再通，修剪尼龍線栓尾部，回籠自然喂養。

2．3評價指標

2．3．1對大鼠神經行為學的影響［1］見表1。

2．3．2對缺血梗死面積的影響

［2］TTC染色：大鼠于造模后72h取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，置－20℃冰箱冰凍20min，沿冠狀面切成5片，每片約2mm，置5mL含有1％TTC的磷酸緩沖溶液中避光溫孵10min染色，4～5min翻動一次。經染色后，正常腦組織呈玫瑰紅色，而梗死組織呈白色。用圖象測量軟件Imagepro－Plus分析腦片面積，分別計算出5個腦片共10個面的總面積和梗死區域的面積，求出梗死區面積占總面積的百分比，即梗死率。

2．3．3對血清超氧化物歧化酶（SOD）

NFκB、caspase3含量的影響造模后72h，于最后一次給藥后0．5h，麻醉大鼠，勁總動脈插管取血，3000r•min－1離心10min，分離血清，用生化法檢測血清SOD活性，用放免法檢測血清NFκB、caspase3含量。

2．4統計學方法

應用SPSS13．0數理統計軟件進行相關數據統計分析，實驗的計量數據資料采用x±s表示，各組間的比較采用t檢驗。當P＜0．05時，差異有統計學意義。

3實驗結果

3．1消栓通絡片與市售消栓通絡片對缺血性腦損傷模型大鼠行為學評分及梗塞率的影響

腦缺血后4h，各給藥組行為學評分均有降低，與模型組相比，依達拉奉組、消栓通絡片高、中劑量組行為學評分均下降（P＜0．01）。其余各組差異無統計學意義（P＞0．05）。24h，市售消栓通絡組和消栓通絡片高中劑量組大鼠行為學評分下降明顯，與模型組相比差異有統計學意義（P＜0．05），其余各給藥組分值也有下降，但與模型組相比差異無統計學意義（P＞0．05）。造模后72h，大鼠腦梗死明顯（P＜0．01），除改工藝低劑量組，其余各給藥組大鼠腦梗塞率均有下降，依達拉奉組下降明顯，與模型組相比差異有顯著性（P＜0．01）。結果見表2。

3．2消栓通絡片與市售消栓通絡片對血清超氧化物歧化酶SOD、NFκB、caspase－3含量的影響

造模后72h，大鼠血清NFκB的含量較假手術組增高（P＜0．05），給予消栓通絡片高、低劑量后，能明顯降低大鼠血清NFκB含量（P＜0．05），其余各組血清NFκB含量與模型組比較差異無統計學意義（P＞0．05）。大鼠血清caspase3含量較假手術組增高（P＜0．05），給予消栓通絡片中、高劑量后，能明顯降低大鼠血清caspase3含量（P＜0．01），其余各組血清caspase3含量與模型組比較差異有統計學意義（P＞0．05）。各組大鼠血清SOD含量在給予市售消栓通絡片和消栓通絡片各劑量組后與模型組比較均有明顯上升（P＞0．01）。結果見表3。

4討論

消栓通絡片由川芎、丹參、黃芪、澤瀉、三七、槐花、桂枝、郁金、木香、冰片、山楂十一味中藥組成，君藥川芎、丹參、郁金中含有水溶性酚酸類化合物［3～4］，其中原兒茶醛和咖啡酸具有廣泛的抑菌、抗病毒、擴張心腦血管、抗血小板凝集作用，原兒茶醛等有強烈的清除氧自由基作用。還含有人參皂苷Rg1、Rb1、三七皂苷R1、黃芪甲苷、丹參酮等。脂溶性成分蘆?。?］屬于黃酮類化合物，有明顯的擴張冠脈的作用，還有抗炎、抗菌、抗病毒等作用，可用于治療毛細血管脆性引起的出血癥等。該方傳統制劑工藝中黃芪、三七、槐花、丹參四味藥材為水提，我們將水提工藝改為用60％醇提。制劑改進后每片含藥量明顯增加，服藥量明顯減少，增加病患用藥依從性：

我們根據文獻的方法加以改進，采用MCAO的方法復制中動脈阻塞的腦缺血模型，觀察改工藝后消栓通絡片與市售消栓通絡片對大鼠局灶性腦缺血的治療作用差異及其作用機制。造模后72h，我們觀察到大鼠腦梗塞率達到20．64％±4．5％，且手術大鼠出現了明顯的神經行為學障礙，和文獻報道相符［6～7］，說明模型復制成功。給予依達拉奉后，在急性期4h，很好緩解MCAO引起的行為學病變，降低行為學評分。給予消栓通絡片與市售消栓通絡片后發現，市售消栓通絡片能很好緩解急性期24h時MCAO引起的行為學病變，降低行為學評分。消栓通絡片高、中劑量組能有效緩解4h、24h時MCAO引起的行為學病變，降低行為學評分。

Caspase家族在缺血性腦損傷中發揮重要作用，其中Caspase－3是Caspase級聯反應中下游最關鍵的凋亡蛋白酶，在各種因素啟動的凋亡程序中起最后的樞紐作用。消栓通絡片高、中劑量組能明顯降低MCAO引起的血清Caspase－3的升高，緩解腦缺血進展期細胞凋亡的持續發生，從而達到腦保護的作用［8～10］。NFκB是細胞內最重要的活性蛋白轉錄調節因子，它調控大量基因的轉錄，包括細胞因子、生長因子、趨化因子、黏附因子、凋亡調控因子、炎癥通路蛋白、細胞應激蛋白等。大量炎性蛋白質的表達對細胞損傷和修復過程至關重要［11－14］。消栓通絡片中、低劑量組對MCAO引起的NFκB的明顯升高有一定抑制作用，從而緩解MCAO后的炎癥反應及細胞凋亡的持續發展，達到腦保護作用。

超氧化物歧化酶（簡稱SOD）是清除生物體內超氧陰離子自由基的一種重要抗氧化酶［2，15］，它能降低氧化應激對腦組織產生的損傷。造模后72h，在給予改工藝消栓通絡片后SOD均有明顯上升，提示改工藝消栓通絡片各劑量組均有良好的抑制腦缺血后氧化應激的作用。

以上結果提示，改工藝后消栓通絡片各劑量組對腦缺血恢復期大鼠均有一定的緩解作用。改工藝消栓通絡片高劑量組在4h，減輕行為學評分的作用有優于市售消栓通絡片的趨勢，消栓通絡片高劑量組對MCAO后大鼠血清Caspase3、NFκB的表達均有一定的抑制作用，效果有優于市售消栓通絡片的趨勢。其保護作用的發揮可能依賴于對炎癥及神經細胞凋亡的雙重抑制作用。依達拉奉對MCAO后72h大鼠腦梗塞率有明顯的減小，說明其有較好抗腦缺血作用，而對72h時大鼠血清SOD活性、Caspase3、NFκB的表達無明顯影響，推測其在72h時，對血清這三個因子影響較小，此時間點依達拉奉并不主要通過影響這三個因子的表達發揮抗腦缺血的作用。

參考文獻：

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作者:李卓瓊 宗紹波 周軍 王振中 蕭偉 單位:江蘇康緣藥業股份有限公司 中藥制藥過程新技術國家重點實驗室