金華豬和長白豬ampk基因的研究范文

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《中國畜牧雜志》2014年第十期

1材料與方法

1.1實驗材料選取不同生長階段30、90、150d去勢金華公豬和長白公豬各4頭，共24頭。屠宰后取豬皮下脂肪組織，投入液氮中迅速冷凍，-80℃冰箱保存。

1.2儀器和試劑ABISteponePlus實時熒光定量PCR儀（ABI公司，美國）；NanoDrop2000（ThermoFisher，美國）；SYBRPremixExTaqTM熒光定量試劑盒（TaKaRa，大連，中國）；96孔定量PCR板（PCR-96-FLT-C）和封板膜購自ABI公司（ABI公司，美國）；RNA提取試劑盒（TrizolReagent）購自lnvitrogen公司（InvitrogenLifeTechnologies，Carlsbad，CA，美國），反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司（ThermoFisher，美國）；DEPC水及其他生化試劑購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

1.3組織總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄利用TrizolReagment（Invitrogen公司）的操作說明進(jìn)行脂肪組織總RNA的提取。利用NanoDrop2000超微量分光光度計進(jìn)行RNA的濃度和純度測定，檢測260nm和280nm下光度A值，并計算OD260/OD280的值，此值在1.9~2.0說明提取的RNA的質(zhì)量純度較高。并進(jìn)行RNA變性凝膠電泳檢測鑒定RNA的完整性后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.4熒光定量PCR檢測

1.4.1引物設(shè)計與合成ampkα1、AMPKα2、ATGL、HSL、ACC和CPT-1基因的熒光定量PCR引物序列的設(shè)計合成，18SrRNA基因引物序列參照Cheung等設(shè)計合成見表1。

1.4.2熒光定量PCR特異性檢測利用ABISteponePlus實時熒光定量PCR儀比較金華豬和長白豬皮下脂肪中AMPK及相關(guān)基因的表達(dá)差異。熒光定量PCR反應(yīng)體系（20μL）：10.4μLSYBRPremixExTaqTM（2x）mix，1.0μLcDNA，7.8μL無酶H2O，上、下游引物各0.4μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火和延伸34s并采集熒光信號，共40個循環(huán)；按儀器操作說明選擇熔解曲線分析，60℃升至95℃，60℃保溫1min，95℃保溫15s，自動采集熒光。

1.5統(tǒng)計分析AMPKα1、AMPKα2、ACC、CPT-1、ATGL和HSL基因相對表達(dá)量用2-ΔΔCt法計算，以18S作為內(nèi)參基因，以金華豬脂肪組織中的基因表達(dá)作為參照，所得結(jié)果即為目的基因在長白豬中的表達(dá)相對于金華豬的倍數(shù)。統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS16.0中One-WayANOVA進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2結(jié)果

2.1金華豬和長白豬由圖1可見，AMPK基因的表達(dá)差異金華豬和長白豬AMPKα1和AMPKα2基因表達(dá)基本一致。30d金華豬AMPKα1和AMPKα2的mRNA表達(dá)水平極顯著低于長白豬（P<0.01）；90d金華豬AMPKα1的mRNA表達(dá)水平低于長白豬（P>0.05），金華豬AMPKα2的mRNA表達(dá)水平顯著高于長白豬（P<0.05）。150d金華豬AMPKα1和AMPKα2基因的mRNA表達(dá)水平均顯著高于長白豬（P<0.05）。

2.3金華豬和長白豬AMPK下游相關(guān)基因的表達(dá)差異30d和90d，金華豬ACC基因表達(dá)水平均極顯著高于長白豬（P<0.01）；150d，金華豬ACC的表達(dá)略低于長白豬，差異不顯著（圖2）。CPT1的表達(dá)受到ACC的抑制，與ACC相反，30d和90d金華豬脂肪組織中CPT1的表達(dá)分別極顯著（P<0.01）和顯著（P<0.05）低于長白豬，150d金華豬高于長白豬（P<0.01）（圖3）。脂肪分解關(guān)鍵酶ATGL和HSL的基因表達(dá)與AMPK基因表達(dá)差異相似，30d金華豬均極顯著低于長白豬（P<0.01），90d金華豬低于長白豬，150d金華豬基因表達(dá)均極顯著高于長白豬（P<0.01）（圖4、5）。

3討論

3.1不同日齡的金華豬和長白豬AMPK基因的差異AMPK是由α功能亞基和β、γ調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成的異源三聚體，且每種亞基都有2~3個亞型，使得其調(diào)節(jié)功能表現(xiàn)出組織的多樣性。α亞基作為功能亞基，在AMPK調(diào)控過程中發(fā)揮著重要的作用。在脂肪組織中AMPK可以促進(jìn)脂肪的分解和脂肪酸的氧化，抑制脂肪的合成。AMPK基因在不同品種豬脂肪組織中的研究鮮見報道。對于AMPK的研究也主要集中在骨骼肌和肝臟組織中。本實驗結(jié)果表明，肉脂型金華豬和瘦肉型長白豬脂肪組織中AMPKα1和AMPKα2表達(dá)規(guī)律存在顯著差異。本課題組前期研究結(jié)果也表明，金華豬體脂沉積主要在機(jī)體發(fā)育前期，而長白豬在生長發(fā)育后期才出現(xiàn)較快的體脂沉積。與金華豬、長白豬體脂沉積規(guī)律一致。金華豬皮下脂肪中AMPK基因表達(dá)在生長前期（30d和90d）低于長白豬，有助于機(jī)體進(jìn)行脂肪合成和脂肪沉積，而生長后期（150d）AMPK基因表達(dá)金華豬高于長白豬，金華豬在進(jìn)行長期的脂肪沉積后，整體的脂肪代謝可能保持在較高水平，脂肪代謝較旺盛。AMPK差異表達(dá)結(jié)果提示，AMPK在豬脂肪組織的脂肪代謝過程中發(fā)揮著一定的作用。

3.2金華豬和長白豬AMPK下游相關(guān)基因的表達(dá)差異AMPK對脂肪沉積的影響主要通過下游相關(guān)基因?qū)崿F(xiàn)。有研究表明，在脂肪組織中，AMPK能夠通過磷酸化抑制ACC的活性或者通過長時調(diào)節(jié)，降低ACC的基因表達(dá)，抑制脂肪酸的合成。ACC的抑制使得丙二酰輔酶A（MCoA）含量減少，進(jìn)而減輕了對CPT-1的抑制，使其氧化分解供能增強(qiáng)。地方品種豬肝臟組織的脂肪合成能力顯著高于地方品種豬，而對于地方品種豬脂肪組織的研究未見報道。本實驗中，在低日齡時，AMPK在金華豬脂肪組織中的表達(dá)顯著低于長白豬，與此相反，其下游的ACC的表達(dá)顯著高于長白豬，而下游CPT-1基因的表達(dá)表現(xiàn)出金華豬顯著低于長白豬?？赡苡捎贏MPK對ACC的抑制作用，使得CPT-1在長白豬脂肪組織中的抑制作用得到緩解，表達(dá)升高。AMPK下游基因ATGL、HSL的表達(dá)規(guī)律與AMPK相一致，提示AMPK可能調(diào)控ATGL和HSL，從而整體上調(diào)控脂肪代謝過程。在生長發(fā)育的早期，金華豬脂肪組織中脂肪分解和脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)較低，提示金華豬在發(fā)育早期就開始進(jìn)行大量的脂肪合成。到了生長發(fā)育后期，長白豬脂肪組織中脂肪分解和脂肪酸氧化相關(guān)基因表達(dá)相對較高，提示長白豬在發(fā)育后期才開始進(jìn)行大量的脂肪合成，而金華豬則表現(xiàn)出比較旺盛的脂肪代謝。AMPK下游基因的表達(dá)差異提示，AMPK對于脂肪代謝的影響可能是通過提高脂肪分解過程來實現(xiàn)的，這與最近的研究成果相一致。

4結(jié)論

本研究結(jié)果表明，不同日齡金華豬和長白豬脂肪組織中AMPK基因表達(dá)存在品種差異。AMPK下游脂肪代謝相關(guān)基因在兩品種豬之間也存在顯著差異。AMPK可能通過調(diào)控下游脂肪代謝相關(guān)基因影響豬體脂沉積。

作者：余秀鋒任陽黃晶汪以真單位：浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所生物飼料安全與污染防控國家工程實驗室農(nóng)業(yè)部飼料與動物營養(yǎng)重點開放實驗室浙江省飼料及動物營養(yǎng)重點實驗室