蠶蛹殼聚糖季銨鹽的制備及性能檢測范文
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摘要:為開發利用蠶蛹殼聚糖及其衍生物，利用2，3－環氧丙基三甲基氯化銨(EPTAC)對自制蠶蛹殼聚糖進行季銨鹽化改性，用紅外光譜對其結構進行了表征，測定了產物的取代度，并對其抑菌效果進行研究。結果表明:在蠶蛹殼聚糖分子中的－NH2上的氫原子已經成功地被EPTAC取代，制備得到了蠶蛹殼聚糖季銨鹽;蠶蛹殼聚糖季銨鹽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌效果，且對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較對大腸桿菌的強。
0引言
蠶蛹殼聚糖為α－型甲殼素脫乙酰衍生物，結晶度較低，因此溶解性強于蝦蟹殼聚糖，蠶蛹殼聚糖在稀酸溶液溶解后，所形成聚合物具有較大透氣性和透濕性［1－5］。蠶蛹殼聚糖溶解性雖強于蝦蟹殼聚糖，但因其殼聚糖分子結構上的功能基團以及分子內、分子間的氫鍵使它的結構緊密，且僅能溶解在酸性溶液中，水溶性較差，這制約了蠶蛹殼聚糖的應用，因此有必要對蠶蛹殼聚糖進行改性，以達到利用其生物活性和生理活性的目的。殼聚糖分子中存在著羥基和氨基的特征結構，這有利于對它進行物理和化學改性，引入化學基團以改善殼聚糖的物理和化學性質。季銨鹽是銨離子中的四個氫原子都被烴基取代而生成的化合物，季銨鹽可以通過胺與鹵代烴反應制取，它易溶于水且有較強的抗菌性能，因其特有的性能被廣泛用于各種化合物改性中［6－10］。目前季銨鹽類消毒劑被廣泛應用于醫療衛生、生物制劑以及農業中。利用季銨鹽對殼聚糖進行改性，若兩者結合既能保留季銨鹽的水溶性好的特點，又能增強兩者都具有的抗菌性能，這樣的化合物將具有更好的應用前景。本研究對蠶蛹來源的殼聚糖進行季銨鹽化改性，并對得到的殼聚糖衍生物進行性能檢測，以初步探討蠶蛹殼聚糖季銨鹽的性能。
1材料與方法
1．1實驗材料
蠶蛹殼聚糖(脫乙酰度70．02%，實驗室自制)，LB培養基、瓊脂粉，2，3－環氧丙基三甲基氯化銨(EPTAC)、鉻酸鉀、硝酸銀、無水乙醇、丙酮、異丙酮及其它藥品均為市購分析純，金黃色葡萄糖球菌、大腸桿菌。
1．2實驗方法
1．2．1蠶蛹殼聚糖季銨鹽的合成制備蠶蛹殼聚糖季銨鹽［11］，稱取蠶蛹殼聚糖10g，加入有500mL異丙醇三口燒瓶中，在溫度(85±5)℃條件下水浴加熱，并進行50r/min攪拌。將2，3－環氧丙基三甲基氯化銨(EPTAC)配置成n(EPTAC)∶n(－NH2)=8∶1的水溶液，用流滴管加入三口燒瓶中，反應8h后固液分離。將所得到的固體用無水乙醇洗滌3次，再用3倍體積丙酮沉淀分離，沉淀物再用丙酮洗滌3次。真空抽濾得到固相產品，置于(45±1)℃的烘箱中烘干，得到的黃色固體產品即為蠶蛹殼聚糖季銨鹽。
1．2．2蠶蛹殼聚糖季銨鹽的取代度測定稱取一定量蠶蛹殼聚糖季銨鹽置于盛有一定量1%醋酸溶液中，以加快蠶蛹殼聚糖季銨鹽的溶解。攪拌至蠶蛹殼聚糖季銨鹽完全溶解后，以鉻酸鉀溶液作為顯色指示劑，加入0．01moL/L的AgNO3標準滴定液進行滴定，測定殼聚糖衍生物樣品中Cl－的含量，將滴定終點的AgNO3體積帶入公式(1)計算蠶蛹殼聚糖季銨鹽取代度。
1．2．3蠶蛹殼聚糖季銨鹽的結構表征采用BRUKER公司的VECTOR22型傅立葉變換紅外光譜儀，用KBr壓片法進行測定。將蠶蛹殼聚糖、蠶蛹殼聚糖季銨鹽分別與KBr混合壓片，以KBr為參比，然后用紅外光譜儀分析，掃描次數15次，測定范圍500～4000cm－1。
1．2．4蠶蛹殼聚糖季銨鹽的抑菌性能采用涂布平板法制備試驗平板，平板中涂布的菌液濃度分別為3×103、3×105和3×107CFU/mL。采用K－B紙片法進行抗菌性能檢測，將濾紙用打孔器制成6mm的圓片，121℃高壓滅菌后烘干，浸泡于1%、0．5%、0．25%的蠶蛹殼聚糖季銨鹽溶液中12h，置于試驗平板中，于37℃培養48h，測定抑菌圈大小。
2結果與分析
2．1蠶蛹殼聚糖季銨鹽的取代度
取代度反應蠶蛹殼聚糖氨基位被取代的百分數，用以衡量取代的難易程度。根據將滴定終點的AgNO3體積帶入公式(1)，計算蠶蛹殼聚糖季銨鹽取代度為33．61%。
2．2蠶蛹殼聚糖季銨鹽的結構表征
在蠶蛹殼聚糖的紅外光譜在1653．87cm－1處存在N－H的彎曲振動峰，而在蠶蛹殼聚糖季銨鹽的紅外圖譜中1653．87cm－1處的N－H的彎曲振動峰已經消失;同時在1653．87cm－1和1479．66cm－1處出現了兩個新的強吸收峰，這是季銨基團中－CH3的吸收峰;除此之外，二者的紅外圖譜波形相對來說沒有明顯差別。以上紅外光譜數據表明蠶蛹殼聚糖分子中的－NH2上的氫原子已經成功地被EPTAC取代，制備得到了蠶蛹殼聚糖季銨鹽。
2．3蠶蛹殼聚糖季銨鹽的抑菌性能
將蠶蛹殼聚糖季銨鹽溶液進行抑菌圈試驗。蠶蛹殼聚糖季銨鹽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌效果，且隨著試驗平板中菌體濃度的增加，抑菌圈直徑有下降的趨勢。在菌體濃度均為3×107CFU/mL的情況下，蠶蛹殼聚糖季銨鹽在金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑較大腸桿菌的大;在菌體濃度均為3×105CFU/mL的情況下，1%蠶蛹殼聚糖季銨鹽在3×105CFU/mL濃度的大腸桿菌中的抑菌圈直徑更大，而0．5%和0．25%蠶蛹殼聚糖季銨鹽則在對金黃色葡萄球菌的抑菌中表現得效果更好。在金黃色葡萄球菌的抑菌試驗中，由于3×103CFU/mL濃度的金黃色葡萄球菌在平板中生長得過于分散，無法分辨蠶蛹殼聚糖季銨鹽各試驗組的抑菌圈大小;在3×107CFU/mL和在3×105CFU/mL兩個濃度的抑菌試驗中，則仍表現出隨菌體濃度增加，抑菌圈直徑下降的結果。這是因為當抑菌劑含量一定時，抑菌圈的大小跟菌體濃度有很大關系，如果菌體濃度過大，會拮抗抑菌劑的作用，導致抑菌圈偏小。
3結論
利用2，3－環氧丙基三甲基氯化銨(EPTAC)對自制蠶蛹殼聚糖進行季銨鹽化改性，得到了取代度為33．61%的蠶蛹殼聚糖季銨鹽。蠶蛹殼聚糖季銨鹽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌效果，且對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較對大腸桿菌的強。
作者：呂金鳳；王小燕；王介平；王海燕；谷山林；曾秀；王永亮；周嬋 單位：重慶市畜牧科學院