狂犬病病毒磷蛋白的研究范文

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《廣東畜牧獸醫科技雜志》2014年第三期

1缺失P基因的狂犬病病毒（def-P）的特性

利用缺失全長P基因的HEP-Flury病毒株的cDNA，通過反向遺傳技術構建缺失P基因的狂犬病病毒def-P。使用與缺陷基因有互補功能的細胞系如BHK-P細胞、NA-P細胞拯救病毒，使缺陷病毒增殖和擴增。在將P蛋白作為組成性表達的細胞系中，Def-P病毒能夠通過感染該細胞系復制自身基因組和產生子代病毒，但是相對于親本病毒其生長速率稍有減慢。相反地，def-P病毒感染不表達P蛋白的細胞則不產生子代病毒。試驗發現在沒有新的P蛋白合成的感染細胞中，def-P病毒可以進行初級RNA轉錄，但在次級RNA轉錄和病毒基因組RNA復制時則需要新合成的P蛋白。另外，試驗還發現def-P對細胞具有中等毒性，這可能與其減緩生長的現象有關。

2狂犬病病毒P蛋白抑制干擾素信號轉錄途徑

狂犬病病毒能夠在產生干擾素的細胞中復制，表明其本身具有某些機制拮抗干擾素的產生。將狂犬病病毒的P蛋白移至啟動子的遠端或刪除后，P蛋白的表達量減少或缺失，狂犬病病毒失去拮抗干擾素產生的能力；P蛋白部分缺失的試驗表明，只有編碼完整的P蛋白才能抑制β-干擾素的表達。酵母雙雜交篩選法證明，STAT1是狂犬病病毒P蛋白的細胞配偶體。P蛋白C末端與STAT1包括DNA結合域及卷曲域的區域相互作用，P蛋白在細胞的表達抑制了α-干擾素和γ干擾素誘導的轉錄應答。P蛋白通過滯留細胞質中活化的STATs，抑制感染細胞中α/β-干擾素和γ-干擾素刺激的JAK-STAT信號。干擾素刺激應答因子和γ激活序列控制基因的表達，在狂犬病病毒SADL16感染的細胞或共轉染質粒表達P蛋白的細胞中被嚴重破壞。相比之下，表達少量P蛋白的重組狂犬病病毒失去抑制JAK-STAT信號的能力。STAT1和STAT2的酪氨酸磷酸化作用在表達狂犬病病毒P蛋白的細胞中沒有被損壞，而是與P蛋白一起沉淀。STAT1局限化與P蛋白局限化有關：在核內表達P蛋白的細胞中，STAT1存在于細胞核內，而在胞質表達P蛋白的細胞中，STAT1也存在于細胞質內。該試驗證實P蛋白能阻礙STAT1在細胞核內結合干擾素應答基因啟動子的階段。這便表明STAT1在細胞質的滯留不是參與干擾素抑制的惟一機制。狂犬病病毒P蛋白可通過阻礙干擾素調節因子3（IRF-3）的磷酸化，拮抗α/β-干擾素。將P基因移至啟動子下游構建的狂犬病病毒SAD△PLP，可引起S386位的磷酸化、二聚化和IRF-3的轉錄活性。由轉染質粒表達的TBK1的IRF-3的磷酸化在野毒型狂犬病病毒感染的細胞或共轉染P蛋白質粒細胞中被消除。說明P蛋白激活IRF-3的上游激酶是必須的，能有效抑制干擾素應答。

3P蛋白與細胞質動力蛋白輕鏈（LC8）的相互作用

P蛋白是一個多功能性的蛋白。用P基因（CVS株）與神經生長因子誘導的PC12細胞（鼠腎上腺嗜鉻神經瘤細胞）cDNA文庫進行酵母雙雜交試驗，探究P蛋白與細胞胞漿內的動力蛋白輕鏈LC8（dyneinlightchain）的相互作用。結果表明，能在病毒粒子中檢測到LC8；P蛋白缺失分析表明LC8與138-172位之間的氨基酸殘基相結合，表明LC8與狂犬病病毒在軸突中的運輸有關。在另外一組獨立試驗中，用狂犬病病毒基因I型（PV株）和基因III型（Mokolavirus）的P基因與人腦cDNA文庫進行酵母雙雜交試驗也觀察到P蛋白與LC8相互作用。P蛋白144-149位序列（（N/S）KXTQT）高度保守，可能是與LC8結合的位點。將與LC8結合的P蛋白保守序列缺失后的重組病毒與親本病毒對乳鼠的致病性試驗，表明LC8不是狂犬病病毒從外周進入中樞神經系統所必須的。LC8曾被認為是連接病毒核蛋白到宿主細胞運輸系統的分子因素，最近的結構研究對該模型提出質疑。構建攜帶和刪除LC8結合域（LC8-BD）的重組狂犬病病毒，試驗表明LC8的刪除并沒有抑制其侵入中樞神經系統，但可顯著減弱病毒在中樞神經系統的轉錄和復制。在RAG2基因敲除小鼠中，證實刪除LC8結合域的重組病毒致弱，說明LC8結合域使初級轉錄減弱，但不會影響狂犬病病毒逆軸突運輸過程，而是通過在神經中削弱早期轉錄和復制以損傷病毒粒子的感染性。

4Def-P病毒的致病性和免疫原性

HEP-Flury毒株是狂犬病病毒中一種最致弱的毒株，可對乳鼠致死，而成鼠即便是顱內接種也不致死。除了表達P蛋白的細胞，def-P病毒對敏感細胞感染率與親本HEP-Flury毒株相同，在其他細胞上則沒有顯著的感染。一組試驗證明，成鼠接種HEP病毒后體重有波動，而接種def-P則沒有；乳鼠以2×103FFU顱內接種rHEP引起100%死亡，相反，即使以2×104顱內接種def-P病毒并不引起乳鼠死亡和任何臨床癥狀。def-P病毒在乳鼠顱內接種后完全不致病的這種特性，是因為def-P能在表達P蛋白的細胞中復制，而在正常的不表達P蛋白的細胞中不能有效復制。用def-P病毒免疫小鼠后可誘導高水平的病毒中和抗體（VNA），而且對所接種小鼠能提供攻毒后的保護力。def-P誘導強大的保護性免疫抵抗狂犬病病毒，幾乎不產生子代病毒和嚴重的宿主損傷。

5近年我國狂犬病病毒P基因的分子遺傳特征

通過對兩株不同疫苗株和兩株分離自寧夏的野毒分析，P基因核苷酸和氨基酸序列相似性分別為83.6%～99.8%和87.2%～99%，P蛋白與胞漿動力蛋白輕鏈LC8相互作用的序列位于143～148位氨基酸殘基，均為DKSTQT，4株病毒P基因作用位點序列顯示未發生影響其生物學功能的變異。而對4株湖南狂犬病病毒P基因與I型狂犬病病毒和疫苗株核苷酸相似性比較,P基因分別為78.4%～90.2%和81.8%～86.8%；核苷酸序列及推導的氨基酸序列表明湖南株與我國現用的人用及獸用疫苗株存在一定差異。進化關系表明，4株病毒均為基因I型狂犬病毒；與我國寧夏分離株最近；與其它I型毒株分離自菲律賓和泰國等東南亞地區的毒株親緣關系較近；而與翼手目的毒株關系最遠。

6小結

分子生物學和反向遺傳學技術的發展，使人們對狂犬病病毒的研究越來越深入。對病毒分子結構、復制周期、致病性和免疫原性方面的研究，為全面認識狂犬病病毒的結構和功能的關系提供理論基礎和試驗支持。對狂犬病病毒P基因的研究，揭示其在整個病毒粒子中的功能和病毒與宿主之間發揮的作用。通過反向遺傳學技術構建的def-P病毒，為將來可研制出高效、安全、廉價且使用方便的狂犬病減毒活疫苗提供了候選疫苗株。

作者：鄭韶結施赫赫單位：佛岡縣高崗鎮農業技術綜合服務站廣東省醫學實驗動物中心