箭筈豌豆根瘤菌耐鹽性研究范文
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《草業(yè)學(xué)報(bào)》2016年第8期
摘要：
箭筈豌豆是我國傳統(tǒng)肥飼兼用的豆科綠肥作物，有關(guān)箭筈豌豆根瘤菌的研究尚屬空白。為獲得抗逆性強(qiáng)的根瘤菌菌株，在青海主產(chǎn)區(qū)采集樣本，經(jīng)分離、鑒定得到61株箭筈豌豆根瘤菌。采用水培回接法，通過主成分分析篩選出5株對宿主結(jié)瘤生長促進(jìn)作用較強(qiáng)的根瘤菌。對該5株根瘤菌進(jìn)行了離體耐鹽性評價，發(fā)現(xiàn)菌株J5－5－3最大耐鹽極限值在0．9％左右，其他4菌株最大耐鹽極限值均在1．2％左右，并且5菌株的耐鹽特征呈3個明顯不同類型：J3－12－1和J2－6－2耐鹽性最強(qiáng)，菌株J1－3－2和J4－3－3居中，菌株J5－5－3最差。進(jìn)一步采用盆栽方法評價了其中3株（每類型1株）根瘤菌－箭筈豌豆共生體的耐鹽性，結(jié)果表明，在0．15％NaCl脅迫下接種根瘤菌J5－5－3植株結(jié)瘤數(shù)最多，在0．30％NaCl脅迫下3種接種處理無顯著差異；在0．15％和0．30％NaCl脅迫下，接種J3－12－1共生體株高顯著大于對照（P＜0．05）；在0．15％和0．30％NaCl脅迫下根瘤菌J3－12－1和J5－5－3可顯著提高植株干重（P＜0．05）；J5－5－3在0．15％和0．30％NaCl脅迫下可顯著提高植株含氮量并顯著提高0．15％NaCl脅迫下的植株吸氮量（P＜0．05）；J3－12－1顯著提高了0．15％NaCl脅迫下的植株吸氮量（P＜0．05）。綜合來看，J3－12－1和J5－5－3可以作為在鹽脅迫下提高箭筈豌豆生物量和含氮量的預(yù)選菌株。
關(guān)鍵詞：
箭筈豌豆；根瘤菌；鹽脅迫
根瘤菌與豆科植物形成的固氮共生體是生物固氮中最強(qiáng)的體系，其固氮量約占生物固氮總量的65％以上，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有重要意義［1］。共生固氮可以為宿主植物提供氮素，從而提高作物產(chǎn)量［2］、改善作物品質(zhì)、提高土壤氮素含量［3］。提高豆科綠肥及飼草固氮效率，是提高鮮草產(chǎn)量、減少化肥用量［4］、減緩能源壓力、降低過量施用化學(xué)肥料造成的環(huán)境污染的有效途徑［5－6］。箭筈豌豆，又名大巢菜，豆科野豌豆屬，一年生或越年生豆科草本植物［7］，性喜冷涼，不怕霜凍，且耐陰性好、再生力強(qiáng)。箭筈豌豆是北方冷涼地區(qū)春季以及南方地區(qū)冬季常用綠肥及飼草作物［8］之一，但目前有關(guān)箭筈豌豆根瘤菌的研究工作少見報(bào)道，生產(chǎn)中還沒有與箭筈豌豆匹配的根瘤菌菌劑。箭筈豌豆根瘤菌研究的欠缺，限制了箭筈豌豆作為豆科綠肥固氮潛能的發(fā)揮。土壤鹽堿化是國內(nèi)外普遍存在的問題。我國鹽堿化耕地超過1．5×109hm2，在青海省等西北干旱半干旱地區(qū)分布面積大。土壤鹽分脅迫對結(jié)瘤和固氮作用的影響在部分研究中有報(bào)道［9］，鹽分對固氮作用的不利影響通常與鹽脅迫所造成的植株干重及氮含量的下降直接相關(guān)［10］，在土壤鹽分脅迫條件下對共生固氮而言最好的結(jié)果就是宿主、根瘤菌以及兩者的交互過程均表現(xiàn)為對鹽分的適應(yīng)［11］。青海地區(qū)是典型的大陸性高原氣候，地形復(fù)雜、地貌多樣、生物種類多，是一個巨大的基因庫。在青海省，箭筈豌豆種植廣泛，且多與小麥、油菜輪作［12－13］，不但可作綠肥，還可以刈青作飼料和收籽作種子。在青海等西北地區(qū)，土壤鹽漬化也是農(nóng)業(yè)面臨的重大問題之一。本研究在對青海地區(qū)箭筈豌豆根瘤菌分離和初篩的基礎(chǔ)上，對初篩獲得的根瘤菌進(jìn)行了耐鹽性研究，為豆科綠肥飼草的應(yīng)用和推廣提供科學(xué)支撐。
1材料與方法
1．1根瘤菌菌株的采集、分離和鑒定
2014年在青海省海東市互助土族自治縣和平安區(qū)采集根瘤樣本，經(jīng)過分離、純化、鏡檢、16SrDNA測序分析，獲得61株根瘤菌（表1），以這些菌株作為后期研究的供試菌株。
1．2供試箭筈豌豆
758選箭豌，由綠肥種質(zhì)資源平臺提供，國家種質(zhì)資源庫編號I7A00224。
1．3根瘤菌結(jié)瘤效果評價
2014年12月進(jìn)行。按照馬曉彤［14］所述的水培方法，設(shè)61個接種根瘤菌處理，1個不接種對照處理，4次重復(fù)。將植株放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（光照16h、光照強(qiáng)度8000lx、有光溫度20℃；無光照8h、無光溫度15℃），定期更換營養(yǎng)液，45d后測定植株地上鮮重、植株有效瘤數(shù)（粉紅色或淺粉紅色）、有效瘤重等指標(biāo)。水培溶液采用松本哲良營養(yǎng)液［15］：KH2PO42．2g，KCl15．5g，MgSO4•7H2O25．0g，CaCl2•2H2O21．5g，檸檬酸鐵3．0g，MnSO4•H2O100mg，ZnSO4•7H2O25mg，H3BO325mg，CuSO4•5H2O25mg，Na2MoO4•2H2O5mg；以上試劑分別溶于500mL蒸餾水中，用時稀釋200倍。
1．4根瘤菌離體耐鹽性評價
2015年1月，將在1．3初篩中獲得的5株固氮效果較好的菌株用于根瘤菌耐鹽性評價。設(shè)8個NaCl處理濃度：0．00，0．30％，0．60％，0．90％，1．20％，1．50％，1．80％，2．10％。配制相應(yīng)NaCl濃度的YMA液體培養(yǎng)基，并將其分裝至1．5cm×15cm試管中，每管5mL，121℃、30min高壓蒸汽滅菌后備用。將根瘤菌轉(zhuǎn)接到根瘤菌斜面培養(yǎng)基中，28℃、72h培養(yǎng)；鏡檢以確定培養(yǎng)物是否被污染，然后轉(zhuǎn)接到Y(jié)MA液體培養(yǎng)基中，28℃、160r／min、72h搖瓶培養(yǎng)；將各菌液OD600值調(diào)一致（OD600＝0．8），取100μL菌液接種于相應(yīng)YMA液體培養(yǎng)基中，3次重復(fù)，28℃、160r／min、72h搖床培養(yǎng)；使用紫外分光光度計(jì)測定不同菌液OD600值。YMA液體培養(yǎng)基［16］：甘露醇10g，酵母膏1g，K2HPO40．5g，MgSO40．2g，NaCl0．1g，H2O1L。根瘤菌培養(yǎng)基：K2HPO40．5g，MgSO4•7H2O0．2g，NaCl0．1g，甘露醇10g，CaCO31．5g，1％Na2MoO42mL，1％H3BO32mL，酵母粉0．8g，0．5％剛果紅5mL，瓊脂22g，pH＝7．0，H2O1L。
1．5共生體耐鹽性研究
采用盆栽試驗(yàn)，2015年4月進(jìn)行。在1．4試驗(yàn)基礎(chǔ)上得到耐鹽性有差異的3個菌株用于本試驗(yàn)。設(shè)3個鹽濃度水平：0．00，0．15％和0．30％，分別接種3個根瘤菌菌株，同時設(shè)1個不接種對照，共12個處理，4次重復(fù)。分別接種3菌株于YMA液體培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)72h，將各菌液OD600值調(diào)一致（OD600＝0．8）。選擇粒大飽滿的箭筈豌豆種子，浸于10％H2O2中5min，洗凈，于培養(yǎng)皿中28℃催芽2d。選擇發(fā)芽一致的種子于相應(yīng)菌液中浸泡1h（不接種根瘤菌對照處理同時進(jìn)行）后播種于裝有蛭石的10cm×10cm×10cm盆缽中，每盆3棵。每處理12盆。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（光照16h、光照強(qiáng)度8000lx、有光溫度20℃；無光照8h、無光溫度15℃），定期澆注Fahraeus無氮營養(yǎng)液。7d后，每處理隨機(jī)分為3組，分別澆灌40mLNaCl含量為0．00，0．15％，0．30％營養(yǎng)液，每3d澆灌1次；第45天測定植株株高、結(jié)瘤數(shù)、干重和含氮量（凱氏定氮法）等指標(biāo)。Fahraeus無氮植物營養(yǎng)液［17］：Na2HPO4•12H2O0．15g，MgSO4•7H2O0．12g，檸檬酸鐵0．005g，CaCl2•2H2O0．1g，KH2PO40．1g，Gibson微量元素液1mL，H2O1000mL（Gibson微量元素液：H3BO32．68g，MnSO4•4H2O2．03g，ZnSO4•7H2O0．22g，Na2MoO4•2H2O1．26g，CuSO4•5H2O0．08g，H2O1000mL）。
1．6數(shù)據(jù)處理
相對OD600值＝接種根瘤菌處理OD600值／對照OD600值。相對OD600值可以用來表征在離體培養(yǎng)條件下根瘤菌的耐鹽性。采用EXCEL2007和SAS8．1進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析。
2結(jié)果與分析
2．1根瘤菌結(jié)瘤效果
利用水培回接法測定了62個處理的有效結(jié)瘤數(shù)、有效瘤重、植株鮮重等指標(biāo)。為了更客觀地進(jìn)行根瘤菌結(jié)瘤效果評價，采用主成分得分法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，根據(jù)特征值大于1且累計(jì)貢獻(xiàn)率大于80％的原則，把測定指標(biāo)轉(zhuǎn)化為累計(jì)貢獻(xiàn)率為86．26％的2個主成分（主成分1和主成分2的方差貢獻(xiàn)率分別為65．67％和20．95％），各處理得分如表2所示。菌株J1－3－2得分最高，對促進(jìn)箭筈豌豆生長結(jié)瘤效果最好；其次為菌株J2－6－2、J4－3－3、J5－5－3和J3－12－1；菌株J5－10－1和J1－2－1得分最低。選擇菌株J1－3－2、J2－6－2、J4－3－3、J5－5－3和J3－12－1用于下一步根瘤菌耐鹽方面研究。
2．2根瘤菌耐鹽性
OD600值是在600nm波長下測定的菌液吸光度，在測定系統(tǒng)相同、培養(yǎng)體系相同的條件下，OD600值與菌液的濃度呈正比，可以用來衡量菌液濃度。圖1表明，菌株J1－3－2、J2－6－2、J4－3－3、J5－5－3和J3－12－1均表現(xiàn)為隨NaCl濃度的提高，菌液OD600值降低，菌濃度下降，根瘤菌的生長受到抑制，并且抑制程度隨NaCl濃度增加而增加。在無鹽脅迫下，5菌株的OD600值略有差異，J1－3－2、J2－6－2的OD600值最高，J5－5－3的其次，J3－12－1、J4－3－3的最低。在0．30％NaCl脅迫下，J5－5－3的OD600值急劇下降，明顯低于其他4菌株，并且菌株J1－3－2、J2－6－2的OD600值依然高于J3－12－1、J4－3－3。在0．60％NaCl條件下，J5－5－3的OD600值進(jìn)一步降低至0．09，J1－3－2、J2－6－2的OD600值略高于J3－12－1、J4－3－3，但4菌株間差異縮小。在0．90％NaCl條件下，各處理OD600值繼續(xù)降低，J5－5－3的OD600值接近0，但總體規(guī)律與0．60％條件下的類似；NaCl濃度超過1．20％后，5菌株OD600值接近0。細(xì)菌生長率受細(xì)菌本身特性的影響較大，不同菌種其生長曲線不同。相對菌濃度（相對OD600值表征）可以更為客觀地反映菌株在鹽脅迫下的相對耐鹽性；在給定鹽度脅迫下，相對菌濃度越大，說明耐鹽性越強(qiáng)。表3可以反映出隨鹽脅迫程度的增強(qiáng)，根瘤菌相對菌濃度及其生長受抑制程度的變化趨勢。在低濃度0．30％NaCl脅迫下，菌株J5－5－3的相對OD600值快速下降，菌株J2－6－2、J4－3－3居中，菌株J1－3－2、J3－12－1受抑制較小，菌株J1－3－2、J3－12－1、J2－6－2、J4－3－3、J5－5－3受抑制率分別為6．7％，6．3％，11．5％，11．2％和67．4％。在中濃度0．60％NaCl脅迫下，各菌株受抑制程度進(jìn)一步增大，但總體規(guī)律與低濃度較為相似，受抑制率分別為37．2％，41．7％，56．1％，49．9％和94．2％。高濃度0．9％NaCl脅迫下，受抑制率分別為67．9％，79．3％，84．7％，86．3％和97．5％。在1．20％～2．10％NaCl濃度范圍內(nèi)，同一種菌液OD600值沒有顯著性變化（P＞0．05）；除根瘤菌J2－6－2外，其他4菌株相對OD600值無顯著性差異。綜上，供試5菌株在離體耐鹽性上綜合表現(xiàn)出明顯的3個類型，即菌株J3－12－1和J2－6－2隨NaCl濃度的增加，相對OD600值下降較緩，表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性，菌株J1－3－2和J4－3－3居中，菌株J5－5－3最差。
2．3根瘤菌－箭筈豌豆共生體耐鹽性
選擇上述3個類型中的各1株根瘤菌，即J1－3－2、J3－12－1和J5－5－3用于根瘤菌－箭筈豌豆共生體耐鹽性盆栽試驗(yàn)。
2．3．1NaCl濃度對箭筈豌豆結(jié)瘤數(shù)的影響
接種3株根瘤菌處理都能增加箭筈豌豆植株根部結(jié)瘤數(shù)，結(jié)瘤數(shù)隨根瘤菌種類和NaCl脅迫強(qiáng)度的不同而不同（圖2）。同時，圖2表明隨著鹽脅迫程度的增強(qiáng)，3種共生體結(jié)瘤數(shù)表現(xiàn)出減少的趨勢。在無鹽脅迫和0．15％NaCl脅迫下，接種J5－5－3結(jié)瘤數(shù)最多，接種J1－3－2結(jié)瘤數(shù)最少；在0．30％NaCl脅迫下，接種J1－3－2結(jié)瘤數(shù)最多，接種J5－5－3結(jié)瘤數(shù)最少。可見，根瘤菌J5－5－3在低鹽脅迫下促結(jié)瘤能力較強(qiáng)；J1－3－2在高鹽脅迫下有促結(jié)瘤的趨勢。
2．3．2NaCl濃度對箭筈豌豆株高的影響
由圖3可知，各根瘤菌－箭筈豌豆共生體株高隨鹽脅迫程度的增強(qiáng)而降低。在無鹽脅迫下，接種J3－12－1共生體株高顯著大于對照（P＜0．05）；接種J1－3－2和J5－5－3與對照相比沒有顯著性差異（P＞0．05）；在0．15％和0．30％NaCl脅迫下，接種J3－12－1共生體株高顯著大于對照（P＜0．05）。
2．3．3NaCl濃度對共生體干生物量的影響
如圖4所示，不同共生體干重隨NaCl脅迫程度的增強(qiáng)而降低。在無鹽脅迫下，J3－12－1和J5－5－3共生體干重顯著高于對照，分別比對照提高了28．02％和13．59％，其中J3－12－1達(dá)極顯著水平（P＜0．01）；在0．15％NaCl脅迫下，J3－12－1和J5－5－3共生體干重分別比對照高66．40％和20．72％，并且差異達(dá)到極顯著水平（P＜0．01）；在0．30％NaCl脅迫下，3種接種處理對提高植株干重都沒有顯著效果（P＞0．05）。
2．3．4NaCl濃度對箭筈豌豆含氮量和吸氮量的影響
如圖5所示，箭筈豌豆含氮量隨著鹽脅迫程度的增強(qiáng)表現(xiàn)出降低的趨勢。在無鹽脅迫和0．15％NaCl脅迫下，接種J5－5－3對提高植株含氮量都有極顯著效果（P＜0．01），比對照分別提高了3．07％和5．43％，接種其他2菌株對提高植株含氮量沒有顯著效果。在0．30％NaCl脅迫下，接種J1－3－2、J3－12－1和J5－5－3能使植株含氮量提高2．35％，0．92％和4．48％。可見，在試驗(yàn)條件下，J5－5－3對提高鹽脅迫下箭筈豌豆含氮量效果最好。在沒有外源氮素供應(yīng)的情況下，植株吸氮量的高低反映了根瘤菌－豆科植物共生體利用空氣中游離態(tài)氮合成銨態(tài)氮并為植物體利用的能力。由圖6可知，在無鹽脅迫和0．15％NaCl脅迫下接種J3－12－1和J5－5－3對提高植株吸氮量都有顯著效果（P＜0．05），分別比對照提高26．92％，9．86％和64．93％，27．27％。在0．30％NaCl脅迫下，各接種處理與不接種相比，植株吸氮量沒有顯著差異（P＞0．05）。
3討論
回接結(jié)瘤試驗(yàn)是確定共生固氮根瘤菌比較可靠的方法。從豆科植株根瘤中分離獲得的菌株只有在原寄主根部結(jié)瘤才能確定該菌為具有結(jié)瘤固氮能力的根瘤菌［18］。水培試驗(yàn)作為簡便、直觀、有效的方法被用于根瘤菌與宿主匹配性研究中。馬曉彤［14］采用水培法初篩獲得了幾株與不同苜蓿品種匹配的根瘤菌；管鳳貞等［19］采用水培法和盆栽法篩選出對紫云英有較好結(jié)瘤固氮效果的根瘤菌。本研究通過水培回接結(jié)瘤試驗(yàn)從61株根瘤菌中初篩出5株與箭筈豌豆共生并且結(jié)瘤效果較好的根瘤菌。本試驗(yàn)結(jié)果，在不同程度鹽脅迫下，根瘤菌耐鹽性表現(xiàn)強(qiáng)弱不同，比如在0．30％NaCl脅迫下菌株J1－3－2和J3－12－1耐鹽性最強(qiáng)，在0．60％NaCl脅迫下菌株J3－12－1耐鹽性最強(qiáng)，在0．90％NaCl脅迫下菌株J2－6－2耐鹽性最強(qiáng)。這可能與細(xì)菌在不同鹽脅迫下體內(nèi)積累親和性溶質(zhì)（氨基酸及衍生物等）來保持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡［20］的能力不同有關(guān)，也可能與誘導(dǎo)菌體耐鹽相關(guān)基因［21］（編碼氨基酸合成基因等）表達(dá)的鹽濃度高低不同有關(guān)。此外，在1．20％～2．10％NaCl范圍內(nèi)，菌液OD值沒有明顯波動，這與郭麗琢等［22］研究的豌豆根瘤菌在1．00％～4．50％NaCl濃度下菌液OD值變化趨勢一致，說明在超過一定程度鹽脅迫下根瘤菌幾乎受到完全抑制而沒有明顯的增殖。分離篩選獲得的耐鹽根瘤菌能否與其寄主形成較好的共生關(guān)系，是科研工作者關(guān)注的問題，因此有必要在鹽脅迫條件下對根瘤菌進(jìn)行盆栽回接試驗(yàn)。本研究中，盆栽試驗(yàn)所用營養(yǎng)液為無氮營養(yǎng)液，接種菌株J3－12－1和J5－5－3能使共生體氮含量增加。這些氮是根瘤菌在宿主根部形成的根瘤將空氣中游離態(tài)氮在固氮酶的作用下轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮供宿主植物利用［23］的結(jié)果。根瘤菌與植株互作能增強(qiáng)共生體抗逆性［24－28］。楊培志［24］研究表明，接種根瘤菌的苜蓿抗非生物脅迫的能力可能來源于三方面：根瘤菌的固氮作用、根瘤菌與苜蓿的共生免疫作用、根瘤菌固氮對植株自身組成變化或其生理應(yīng)答機(jī)制的改變。王衛(wèi)棟等［25］的研究表明，接種根瘤菌激活的紫花苜蓿具有較強(qiáng)的抗氧化和滲透調(diào)節(jié)能力，接種根瘤菌不激活的紫花苜蓿次之，不接種根瘤菌的紫花苜蓿最弱。抗氧化和滲透調(diào)節(jié)能力增強(qiáng)，說明苜蓿耐鹽能力提高，也同樣說明接種根瘤菌后形成的共生體耐鹽性可能發(fā)生變化。本研究中，菌株J5－5－3在根瘤菌耐鹽性的離體鑒定中表現(xiàn)最差，但在共生體耐鹽性鑒定中其共生體在干重、吸氮量等方面表現(xiàn)較好，說明在離體培養(yǎng)條件下測定的相關(guān)生理指標(biāo)不能完全與實(shí)際應(yīng)用條件下的相關(guān)指標(biāo)相符，原因可能是根瘤菌需與宿主之間形成較好的匹配性。共生體的形成是一個根瘤菌與植株互作的復(fù)雜過程［29］，在此過程中，菌體和植物體雙方自身組成、生理特性及生理應(yīng)答機(jī)制發(fā)生不同程度變化。因此，在對根瘤菌進(jìn)行篩選和耐鹽性研究時，需關(guān)注其在離體培養(yǎng)和生產(chǎn)應(yīng)用中表現(xiàn)出的生理特性的差異。同時，所選出的高效共生體系在實(shí)際生產(chǎn)環(huán)境中的效果要通過鹽漬地大田試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證［30］，使根瘤菌能在與豆科綠肥聯(lián)合固氮和提高植株耐鹽能力方面發(fā)揮更好的潛力。
4結(jié)論
本研究對青海高原土著箭筈豌豆根瘤菌進(jìn)行了篩選及耐鹽性評價。篩選出5株結(jié)瘤效果較好的根瘤菌J1－3－2、J2－6－2、J3－12－1、J4－3－3和J5－5－3。離體培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果，5個菌株在不同程度鹽脅迫下耐鹽性強(qiáng)弱不同，呈三類明顯的特征，即J3－12－1和J2－6－6耐鹽性最強(qiáng)，J1－3－2和J4－3－3居中，J5－5－3最差。共生體耐鹽性鑒定結(jié)果與離體培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果不盡一致，表現(xiàn)為接種J3－12－1和J5－5－3在中、低濃度NaCl脅迫下促進(jìn)共生體生長能力較強(qiáng)。總體來看，菌株J3－12－1和J5－5－3具有耐鹽性應(yīng)用前景。
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作者:王雪翠 馬曉彤 韓梅 曹衛(wèi)東 張宏亮 白金順 曾鬧華 高嵩涓 周國朋 王艷秋 單位:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院 青海大學(xué)青海省農(nóng)林科學(xué)院土壤肥料研究所