纖維素分解菌的分離鑒定范文

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1生理生化特性試驗(yàn)

1．1菌株在不同pH下的生長(zhǎng)狀況在CMC培養(yǎng)基中，分別用1mol／L鹽酸和1mol／L氫氧化鈉調(diào)pH6．0、6．5、7．0、7．5、8．0，每個(gè)梯度3個(gè)平行，按照1∶20（V／V）接種活化的菌液，30℃靜置培養(yǎng)24h，測(cè)定600nm處吸光度。

1．2細(xì)菌在不同溫度下的生長(zhǎng)狀況設(shè)置20、25、30、35、40、45℃共6個(gè)溫度梯度，每個(gè)梯度3個(gè)平行，按照1∶20（V／V）分別接種活化的菌液，30℃靜置培養(yǎng)24h，測(cè)定600nm處吸光度。

1．3不同碳源下生長(zhǎng)曲線的制作根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)論，采用該菌生長(zhǎng)最佳的pH和溫度，選取不同的碳源（葡萄糖和CMC）分別配置基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基。分別按照1∶20（V／V）接種活化的菌液，混合均勻后分別取5mL混合液放入54支無(wú)菌試管中，37℃振蕩培養(yǎng)，分別培養(yǎng)0、2、4、6、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、42、45、48h，每組3個(gè)平行，用未接種的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，選用600nm波長(zhǎng)進(jìn)行光電比濁測(cè)定，以生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作生長(zhǎng)曲線［3］。

1．4菌株酶活的測(cè)定由于菌株產(chǎn)生的纖維素酶將纖維素分解為單糖，所以酶活的測(cè)定采用DNS法［4－7］。

2結(jié)果與分析

2．1產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選結(jié)果

通過(guò)篩選試驗(yàn)，在鑒別培養(yǎng)基上，一些菌落周圍有透明圈，其中一株菌株產(chǎn)生的透明圈明顯，表明該菌株具有較強(qiáng)的分解纖維素的能力（圖1）。

2．2形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

革蘭氏染色結(jié)果表明，該產(chǎn)纖維素酶菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，為短桿狀。由圖2可知，在CMC固體培養(yǎng)基上該菌株菌落呈現(xiàn)規(guī)則、淺黃色、圓形、邊緣整齊、表面光滑、凸起、濕潤(rùn)不透明的特征。該菌株在半固體培養(yǎng)基中穿刺的形狀為蕪菁狀。半固體培養(yǎng)基表面穿刺口長(zhǎng)有該菌株，穿刺線模糊，說(shuō)明該菌株為兼性厭氧型。

2．3菌株生理生化特性

2．3．1pH和溫度對(duì)產(chǎn)纖維素酶菌株生長(zhǎng)的影響由圖3可知，產(chǎn)纖維素酶菌株在pH6．0～8．0的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，在pH6．6～7.5的范圍內(nèi)生長(zhǎng)較好，適宜的pH在7．0左右。由圖4可知，該菌在溫度為20～40℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，在溫度為30～37℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)較好，適宜的溫度為35℃。

2．3．2產(chǎn)纖維素酶菌株的生長(zhǎng)曲線以葡萄糖為碳源，產(chǎn)纖維素酶菌株的生長(zhǎng)曲線如圖5。由圖5可知，0～4h為延滯期，出現(xiàn)的原因可能是菌種為適應(yīng)新的環(huán)境條件，合成新的酶，積累必要的中間產(chǎn)物。該時(shí)期的特點(diǎn)為：①菌體生長(zhǎng)速率常數(shù)接近零；②對(duì)外界條件、理化因素反應(yīng)敏感。4～17h為對(duì)數(shù)期，出現(xiàn)的原因可能是由于延滯期大量合成細(xì)胞分裂所需要的物質(zhì)并且營(yíng)養(yǎng)豐富，細(xì)胞分裂所需要的物質(zhì)充足，細(xì)胞迅速分裂。在該階段，菌體大量分裂，數(shù)量迅速增加。17～26h為穩(wěn)定期，出現(xiàn)的原因可能為：①營(yíng)養(yǎng)物尤其是生長(zhǎng)因子的耗盡；②營(yíng)養(yǎng)物的比例失調(diào)；③堿、毒素等有害代謝產(chǎn)物的積累及次級(jí)代謝產(chǎn)物的反饋抑制作用；④pH、氧化還原電位等物理化學(xué)條件對(duì)菌體生長(zhǎng)越來(lái)越不適宜。該時(shí)期的菌體生長(zhǎng)的特點(diǎn)為：菌體生長(zhǎng)速率常數(shù)等于零。26～29h為衰亡期，出現(xiàn)的原因可能是：①營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡和有毒代謝產(chǎn)物的大量積累。②細(xì)菌死亡速超過(guò)新生速率，整個(gè)群體呈現(xiàn)出負(fù)增長(zhǎng)。③菌體在衰亡期的后期，由于部分細(xì)菌產(chǎn)生抗性會(huì)使細(xì)菌死亡的速率降低，因此仍有部分活菌存在。在該階段，出現(xiàn)菌種死亡速率超過(guò)生長(zhǎng)速率，并且細(xì)菌自溶，以及釋放一些含堿性的有毒物質(zhì)等。產(chǎn)纖維素酶菌株在以CMC為碳源的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖6。比較圖5和圖6可知，在以葡萄糖為碳源和以CMC為碳源的培養(yǎng)基中該菌株均能生長(zhǎng)得很好。不同的地方是，該菌株在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)周期較在以CMC為碳源的培養(yǎng)基中短，在以CMC為碳源的培養(yǎng)基中該菌株的生長(zhǎng)周期明顯增長(zhǎng)且延滯期的時(shí)間也較長(zhǎng)，原因可能是種子菌株在接種到以CMC為碳源的培養(yǎng)基中后，培養(yǎng)的外在條件發(fā)生了較大的變化，纖維素酶可能是該菌株的一種誘導(dǎo)酶，菌體先要合成出纖維素酶后才能在CMC培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、繁殖，所以，在CMC培養(yǎng)基中延滯期和生長(zhǎng)周期都較長(zhǎng)。

2．3．3酶活的測(cè)定結(jié)果酶活的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，產(chǎn)纖維素酶菌株在以CMC為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h時(shí)，纖維素酶活性達(dá)到最大值35．5IU／mL，另外，與該菌株在以CMC作為碳源的培養(yǎng)基中所測(cè)的生長(zhǎng)曲線相對(duì)照可以看出，該菌株在以CMC為碳源的培養(yǎng)基中合成纖維素酶的能力與該菌株的生長(zhǎng)狀況表現(xiàn)基本一致，即隨著纖維素酶合成的增加，該菌株的生長(zhǎng)和繁殖能力越強(qiáng)。

3結(jié)論

試驗(yàn)首先從富含纖維素的外界環(huán)境（富含枯枝落葉的河底淤泥）中通過(guò)富集培養(yǎng)、分離鑒定等得到1株能夠分解纖維素的細(xì)菌菌株，而后對(duì)其形態(tài)學(xué)、生理生化特性、生長(zhǎng)曲線、產(chǎn)酶能力等進(jìn)行了初步研究。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，初步證實(shí)該菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，形態(tài)為短桿狀，營(yíng)養(yǎng)類型為兼性厭氧型。該菌株的最適生長(zhǎng)溫度為35℃，最適生長(zhǎng)pH7．0左右。另外，分別在以葡萄糖和CMC為碳源的環(huán)境中對(duì)其進(jìn)行生長(zhǎng)情況的觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)該菌株在以CMC為碳源的培養(yǎng)基中延滯期較長(zhǎng)、生長(zhǎng)周期也較在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中長(zhǎng)。初步推測(cè)，纖維素酶為該菌株體內(nèi)的一種誘導(dǎo)酶，只有當(dāng)環(huán)境中葡萄糖消耗完時(shí)，該菌株細(xì)胞內(nèi)才開(kāi)始合成此酶，同時(shí)，測(cè)定該菌株在CMC培養(yǎng)基中生長(zhǎng)48h時(shí)纖維素酶活性達(dá)到最大值，為35．5IU／mL。

作者：唐紅楓方珍羅駿孫茜單位：武漢東湖學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院湖北省疾病預(yù)防控制中心