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1生理生化特性試驗
1.1菌株在不同pH下的生長狀況在CMC培養(yǎng)基中,分別用1mol/L鹽酸和1mol/L氫氧化鈉調pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,每個梯度3個平行,按照1∶20(V/V)接種活化的菌液,30℃靜置培養(yǎng)24h,測定600nm處吸光度。
1.2細菌在不同溫度下的生長狀況設置20、25、30、35、40、45℃共6個溫度梯度,每個梯度3個平行,按照1∶20(V/V)分別接種活化的菌液,30℃靜置培養(yǎng)24h,測定600nm處吸光度。
1.3不同碳源下生長曲線的制作根據(jù)前期試驗結論,采用該菌生長最佳的pH和溫度,選取不同的碳源(葡萄糖和CMC)分別配置基礎液體培養(yǎng)基。分別按照1∶20(V/V)接種活化的菌液,混合均勻后分別取5mL混合液放入54支無菌試管中,37℃振蕩培養(yǎng),分別培養(yǎng)0、2、4、6、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、42、45、48h,每組3個平行,用未接種的培養(yǎng)基作為空白對照,選用600nm波長進行光電比濁測定,以生長時間為橫坐標,吸光度為縱坐標作生長曲線[3]。
1.4菌株酶活的測定由于菌株產生的纖維素酶將纖維素分解為單糖,所以酶活的測定采用DNS法[4-7]。
2結果與分析
2.1產纖維素酶菌株的篩選結果
通過篩選試驗,在鑒別培養(yǎng)基上,一些菌落周圍有透明圈,其中一株菌株產生的透明圈明顯,表明該菌株具有較強的分解纖維素的能力(圖1)。
2.2形態(tài)學觀察結果
革蘭氏染色結果表明,該產纖維素酶菌株為革蘭氏陽性菌,為短桿狀。由圖2可知,在CMC固體培養(yǎng)基上該菌株菌落呈現(xiàn)規(guī)則、淺黃色、圓形、邊緣整齊、表面光滑、凸起、濕潤不透明的特征。該菌株在半固體培養(yǎng)基中穿刺的形狀為蕪菁狀。半固體培養(yǎng)基表面穿刺口長有該菌株,穿刺線模糊,說明該菌株為兼性厭氧型。
2.3菌株生理生化特性
2.3.1pH和溫度對產纖維素酶菌株生長的影響由圖3可知,產纖維素酶菌株在pH6.0~8.0的范圍內均能生長,在pH6.6~7.5的范圍內生長較好,適宜的pH在7.0左右。由圖4可知,該菌在溫度為20~40℃范圍內均能生長,在溫度為30~37℃范圍內生長較好,適宜的溫度為35℃。
2.3.2產纖維素酶菌株的生長曲線以葡萄糖為碳源,產纖維素酶菌株的生長曲線如圖5。由圖5可知,0~4h為延滯期,出現(xiàn)的原因可能是菌種為適應新的環(huán)境條件,合成新的酶,積累必要的中間產物。該時期的特點為:①菌體生長速率常數(shù)接近零;②對外界條件、理化因素反應敏感。4~17h為對數(shù)期,出現(xiàn)的原因可能是由于延滯期大量合成細胞分裂所需要的物質并且營養(yǎng)豐富,細胞分裂所需要的物質充足,細胞迅速分裂。在該階段,菌體大量分裂,數(shù)量迅速增加。17~26h為穩(wěn)定期,出現(xiàn)的原因可能為:①營養(yǎng)物尤其是生長因子的耗盡;②營養(yǎng)物的比例失調;③堿、毒素等有害代謝產物的積累及次級代謝產物的反饋抑制作用;④pH、氧化還原電位等物理化學條件對菌體生長越來越不適宜。該時期的菌體生長的特點為:菌體生長速率常數(shù)等于零。26~29h為衰亡期,出現(xiàn)的原因可能是:①營養(yǎng)物質耗盡和有毒代謝產物的大量積累。②細菌死亡速超過新生速率,整個群體呈現(xiàn)出負增長。③菌體在衰亡期的后期,由于部分細菌產生抗性會使細菌死亡的速率降低,因此仍有部分活菌存在。在該階段,出現(xiàn)菌種死亡速率超過生長速率,并且細菌自溶,以及釋放一些含堿性的有毒物質等。產纖維素酶菌株在以CMC為碳源的培養(yǎng)基中的生長曲線見圖6。比較圖5和圖6可知,在以葡萄糖為碳源和以CMC為碳源的培養(yǎng)基中該菌株均能生長得很好。不同的地方是,該菌株在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中的生長周期較在以CMC為碳源的培養(yǎng)基中短,在以CMC為碳源的培養(yǎng)基中該菌株的生長周期明顯增長且延滯期的時間也較長,原因可能是種子菌株在接種到以CMC為碳源的培養(yǎng)基中后,培養(yǎng)的外在條件發(fā)生了較大的變化,纖維素酶可能是該菌株的一種誘導酶,菌體先要合成出纖維素酶后才能在CMC培養(yǎng)基中生長、繁殖,所以,在CMC培養(yǎng)基中延滯期和生長周期都較長。
2.3.3酶活的測定結果酶活的測定結果見圖7。由圖7可知,產纖維素酶菌株在以CMC為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h時,纖維素酶活性達到最大值35.5IU/mL,另外,與該菌株在以CMC作為碳源的培養(yǎng)基中所測的生長曲線相對照可以看出,該菌株在以CMC為碳源的培養(yǎng)基中合成纖維素酶的能力與該菌株的生長狀況表現(xiàn)基本一致,即隨著纖維素酶合成的增加,該菌株的生長和繁殖能力越強。
3結論
試驗首先從富含纖維素的外界環(huán)境(富含枯枝落葉的河底淤泥)中通過富集培養(yǎng)、分離鑒定等得到1株能夠分解纖維素的細菌菌株,而后對其形態(tài)學、生理生化特性、生長曲線、產酶能力等進行了初步研究。根據(jù)試驗結果,初步證實該菌株為革蘭氏陽性菌,形態(tài)為短桿狀,營養(yǎng)類型為兼性厭氧型。該菌株的最適生長溫度為35℃,最適生長pH7.0左右。另外,分別在以葡萄糖和CMC為碳源的環(huán)境中對其進行生長情況的觀測,發(fā)現(xiàn)該菌株在以CMC為碳源的培養(yǎng)基中延滯期較長、生長周期也較在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中長。初步推測,纖維素酶為該菌株體內的一種誘導酶,只有當環(huán)境中葡萄糖消耗完時,該菌株細胞內才開始合成此酶,同時,測定該菌株在CMC培養(yǎng)基中生長48h時纖維素酶活性達到最大值,為35.5IU/mL。
作者:唐紅楓方珍羅駿孫茜單位:武漢東湖學院生命科學與化學學院湖北省疾病預防控制中心