高溫對(duì)蝦白斑病毒的影響范文
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作者：吳曉果熊海濤杜華華單位：浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所
細(xì)胞免疫
對(duì)蝦血淋巴細(xì)胞分為透明細(xì)胞、半顆粒細(xì)胞和顆粒細(xì)胞，主要具有吞噬、包囊和胞吐功能，能夠合成和釋放多種免疫活性因子參與體液免疫［16］。研究發(fā)現(xiàn)，30℃高溫組的羅氏沼蝦（Macrobrachiumrosenbergii）血淋巴細(xì)胞的吞噬和清除能力顯著高于20℃常溫組，說明高溫具有促進(jìn)對(duì)蝦血淋巴細(xì)胞免疫力的作用［17］。而且高溫感染組對(duì)蝦的血淋巴細(xì)胞總數(shù)顯著高于常溫感染組［10］，表明在高溫下感染對(duì)蝦白斑綜合征病毒能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞非特異性免疫力升高。
體液免疫
對(duì)蝦等甲殼類動(dòng)物體內(nèi)沒有類似T淋巴細(xì)胞和免疫球蛋白等特異性抗體，酚氧化酶激活系統(tǒng)在對(duì)蝦非特異性免疫中起著關(guān)鍵作用。酚氧化酶是合成黑色素的關(guān)鍵酶，能誘導(dǎo)多種血淋巴細(xì)胞的體液防御反應(yīng)［18］。在高溫下用美人魚發(fā)光桿菌（Photobacteriumdamsel）感染對(duì)蝦，其酚氧化酶、超氧化物歧化酶、呼吸爆發(fā)活性均顯著高于常溫感染組［19］。高溫下感染對(duì)蝦白斑綜合征病毒的日本囊對(duì)蝦（Marsupenaeusjaponicas）誘導(dǎo)出的酚氧化酶活性顯著高于常溫感染組［10］。表明高溫條件下感染對(duì)蝦白斑綜合征病毒，對(duì)蝦的非特異性免疫力高于常溫感染組，能夠在一定程度上抵御感染。
細(xì)胞凋亡
細(xì)胞凋亡是高度調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡，在維持多細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞數(shù)量和組織大小等方面具有十分重要的作用。在細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞內(nèi)外凋亡信號(hào)依靠著一系列精確調(diào)控的半胱氨酸蛋白酶介導(dǎo)的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)和能量依賴性，最后由半胱氨酸蛋白酶－3執(zhí)行關(guān)鍵的凋亡程序［20］。在病毒感染宿主細(xì)胞的過程中，病毒會(huì)激發(fā)宿主細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)感受器，隨即激發(fā)細(xì)胞內(nèi)的凋亡反應(yīng)。當(dāng)病毒感染細(xì)胞誘發(fā)凋亡后，感染細(xì)胞會(huì)通過提前溶解，形成凋亡小體并被周圍的細(xì)胞吞噬，不引起炎癥反應(yīng)，進(jìn)而起到消滅病毒的作用，所以細(xì)胞凋亡在宿主細(xì)胞抵抗病毒感染的過程中起著重要作用［21－22］。另一方面，入侵的病毒為了復(fù)制更多的子代病毒，會(huì)分泌多種抗凋亡蛋白與凋亡通路中的關(guān)鍵蛋白作用，起到阻斷或者延遲細(xì)胞凋亡的作用［20］。整個(gè)病毒感染過程中，宿主細(xì)胞的凋亡和病毒蛋白的抗凋亡作用相互對(duì)抗，特別是在病毒感染的初期尤為關(guān)鍵。
高溫感染對(duì)蝦白斑綜合征病毒誘發(fā)的細(xì)胞凋亡
在常溫下感染對(duì)蝦白斑綜合征病毒后，隨著病毒感染程度的加重，斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeusmonodon）細(xì)胞凋亡指數(shù)上升，直至死亡［23］。對(duì)人正常皮膚和尖銳濕疣的皮膚局部高溫處理后，均檢測(cè)到了凋亡信號(hào)［24］，表明病毒和高溫均能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡。高溫感染組的凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeusvannamei）的平均凋亡指數(shù)顯著高于常溫攻毒組（P＜0．05），在觸角腺、甲殼下上皮組織、結(jié)締組織、心臟、肝胰腺、淋巴器官、心包膜、胃上皮中均檢測(cè)到了不同程度的細(xì)胞凋亡，而到感染后期凋亡指數(shù)下降［25］。這個(gè)趨勢(shì)與對(duì)蝦白斑綜合征病毒在高溫條件下的增殖趨勢(shì)一致（結(jié)果待發(fā)表①），表明細(xì)胞凋亡對(duì)于對(duì)蝦白斑綜合征病毒在宿主體內(nèi)的增殖具有一定的抑制作用。在凋亡信號(hào)通路中，需要活化一系列的半胱氨酸蛋白酶，最后由半胱氨酸蛋白酶－3執(zhí)行凋亡程序。目前，已在斑節(jié)對(duì)蝦、墨吉明對(duì)蝦（Fennero－penaeusmerguiensis）、凡納濱對(duì)蝦中成功克隆出了半胱氨酸蛋白酶－3，對(duì)蝦白斑綜合征病毒感染會(huì)誘導(dǎo)其表達(dá)量顯著增加（P＜0．05）［26－28］。在日本囊對(duì)蝦中，用RNAi干擾半胱氨酸蛋白酶后，宿主細(xì)胞的凋亡率下降，病毒增殖［29］。進(jìn)一步表明細(xì)胞凋亡對(duì)于宿主細(xì)胞抵抗對(duì)蝦白斑綜合征病毒感染的重要性。
病毒的抗凋亡作用
研究發(fā)現(xiàn)，用非特異性凋亡誘導(dǎo)劑放線菌素D處理細(xì)胞后，會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，但是用對(duì)蝦白斑綜合征病毒感染后，會(huì)抑制細(xì)胞凋亡［30］。在細(xì)胞凋亡抑制過程中，對(duì)蝦白斑綜合征病毒合成了多個(gè)抗凋亡蛋白作用于細(xì)胞凋亡途徑的不同蛋白。目前發(fā)現(xiàn)的對(duì)蝦白斑綜合征病毒抗凋亡基因有ORF390、WSSV222和VP38等，其產(chǎn)物分別通過切割半胱氨酸蛋白酶－3的DEVD272↓G和半胱氨酸蛋白酶－9的VETD233↓G、LEHD303↓G位點(diǎn)、利用泛素化作用介導(dǎo)腫瘤抑制樣蛋白降解、抑制半胱氨酸蛋白酶－3啟動(dòng)子的活性來發(fā)揮抗凋亡作用［31－33］。但是關(guān)于高溫與對(duì)蝦白斑綜合征病毒抗凋亡基因作用之間的關(guān)系尚未見報(bào)道。
熱休克蛋白
熱休克蛋白具有高保守序列，在各物種中均有表達(dá)。熱休克蛋白具有折疊、組裝、細(xì)胞內(nèi)定位、分泌、調(diào)控和降解其他蛋白的作用。根據(jù)熱休克蛋白的序列同源性和分子質(zhì)量，將熱休克蛋白分為熱休克蛋白110、熱休克蛋白100、熱休克蛋白90、熱休克蛋白70、熱休克蛋白60、熱休克蛋白40、熱休克蛋白10和小熱休克蛋白家族［34］。生物體受到應(yīng)激（如高溫、氧化應(yīng)激、細(xì)菌、病毒感染等）都會(huì)誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)，而熱休克蛋白70家族的基因序列最保守，研究得也最深入，細(xì)胞受到應(yīng)激后變化最顯著［35］。熱休克蛋白70家族主要包含有組成型熱休克蛋白70和誘導(dǎo)型熱休克蛋白70［36－37］。在正常環(huán)境條件下，組成型熱休克蛋白70在各物種中均保持低水平表達(dá)，即使在應(yīng)激條件下，其表達(dá)量變化也不顯著［38－39］。但在應(yīng)激條件下，誘導(dǎo)型熱休克蛋白70表達(dá)量則會(huì)顯著升高［40－41］。雖然二者在表達(dá)模式上差異極大，但結(jié)構(gòu)相似：在N－末端44ku的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C－末端30ku的底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域［42］。目前發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)型熱休克蛋白70基因缺失內(nèi)含子，而組成型熱休克蛋白70含有內(nèi)含子［43］，這種基因上的結(jié)構(gòu)正好對(duì)應(yīng)誘導(dǎo)型熱休克蛋白70，能夠在應(yīng)激狀態(tài)下快速表達(dá)，有效保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激損害。高溫能夠誘導(dǎo)誘導(dǎo)型熱休克蛋白70的表達(dá)，提高宿主細(xì)胞的耐熱性，幫助細(xì)胞度過高溫應(yīng)激狀態(tài)。
1組成型熱休克蛋白
70對(duì)高溫對(duì)蝦白斑綜合征病毒感染的作用目前，已在斑節(jié)對(duì)蝦、中國(guó)明對(duì)蝦（F．chinen－sis）、凡納濱對(duì)蝦、羅氏沼蝦等主要對(duì)蝦中克隆出組成型熱休克蛋白70，為研究其作用機(jī)制提供了豐富的理論基礎(chǔ)［44－47］。研究發(fā)現(xiàn)，在乳頭瘤病毒、腺病毒、輪狀病毒感染宿主細(xì)胞時(shí)，組成型熱休克蛋白70能夠協(xié)助病毒入侵細(xì)胞、病毒蛋白組裝、降解、細(xì)胞轉(zhuǎn)換、病毒DNA復(fù)制等［48－50］，表明組成型熱休克蛋白70能夠誘導(dǎo)一些病毒感染宿主細(xì)胞。在對(duì)蝦白斑綜合征病毒感染對(duì)蝦過程中，組成型熱休克蛋白70依靠其三磷酸腺苷結(jié)合結(jié)構(gòu)域和多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與對(duì)蝦白斑綜合征病毒系統(tǒng)性感染相關(guān)蛋白VP28作用，表現(xiàn)出特異性結(jié)合和三磷酸腺苷依耐性，協(xié)助其感染宿主細(xì)胞［51－52］。在常溫下，對(duì)蝦白斑綜合征病毒感染初期，組成型熱休克蛋白70的表達(dá)量升高，半胱氨酸蛋白酶－3活性很低；但在感染晚期，組成型熱休克蛋白70的表達(dá)量下降，半胱氨酸蛋白酶－3的活性顯著升高；用組成型熱休克蛋白70的dsRNA作用對(duì)蝦白斑綜合征病毒感染對(duì)蝦發(fā)現(xiàn)，其細(xì)胞內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶－3活性顯著升高［53］。這種組成型熱休克蛋白70的表達(dá)水平與宿主細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系表明，對(duì)蝦白斑綜合征病毒的感染能夠誘導(dǎo)宿主組成型熱休克蛋白70的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，最后病毒順利增殖。而在高溫下，組成型熱休克蛋白70的mRNA表達(dá)量?jī)H在高溫應(yīng)激的1h內(nèi)增加2～3倍，0．5h后即恢復(fù)至正常水平［44］。前期研究表明，組成型熱休克蛋白70受到高溫和病毒刺激后的短暫時(shí)間內(nèi)表達(dá)量上升，隨即恢復(fù)到正常水平，但是組成型熱休克蛋白70正常表達(dá)量較少，所以在高溫抑制對(duì)蝦白斑綜合征病毒感染的過程中并不會(huì)起主導(dǎo)作用，不會(huì)影響整個(gè)感染過程。
2誘導(dǎo)型熱休克蛋白
70對(duì)高溫對(duì)蝦白斑綜合征病毒感染的作用誘導(dǎo)型熱休克蛋白70是熱應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白，具有高保守性和分子伴侶作用，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮蛋白折疊、細(xì)胞周期調(diào)控和抗凋亡作用［54］。在羅氏沼蝦（GenBankNo：AY466445）、斑節(jié)對(duì)蝦（GenBankNo：AF474375）、凡納濱對(duì)蝦（GenBankNo：AY645906）、克氏原螯蝦（Procambarusclar－kii）（GenBankNo：DQ301506）等主要養(yǎng)殖對(duì)蝦中成功地克隆出了誘導(dǎo)型熱休克蛋白70。基于這些基因信息，針對(duì)高溫抑制對(duì)蝦白斑綜合征病毒增殖的分子機(jī)制展開工作，能夠深入研究誘導(dǎo)型熱休克蛋白70的作用。在對(duì)流感病毒和仙臺(tái)病毒的高溫研究中發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)型熱休克蛋白70能夠抑制細(xì)胞核釋放核糖核酸蛋白復(fù)合體來阻止流感病毒的增殖［55］；誘導(dǎo)型熱休克蛋白70能夠破壞HN蛋白的組裝來抑制仙臺(tái)病毒的復(fù)制［56］。伴隨高溫抑制對(duì)蝦白斑綜合征發(fā)病的過程，對(duì)蝦白斑綜合征病毒的增殖受到顯著的抑制，誘導(dǎo)型熱休克蛋白70的mRNA水平和蛋白水平均顯著升高；通過特異的RNA干擾作用，誘導(dǎo)型熱休克蛋白70的表達(dá)水平下降，對(duì)蝦白斑綜合征病毒增殖［57］。這表明誘導(dǎo)型熱休克蛋白70的表達(dá)升高能夠顯著抑制對(duì)蝦白斑綜合征病毒的增殖，但是關(guān)于二者相互作用的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。誘導(dǎo)型熱休克蛋白70依賴其ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能夠與線粒體途徑的上游和下游關(guān)鍵凋亡蛋白相互作用，抑制細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑［58］。雖然誘導(dǎo)型熱休克蛋白70具有一定的抗凋亡作用，但是在高溫抑制對(duì)蝦白斑綜合征發(fā)病的過程中，細(xì)胞凋亡率顯著高于常溫感染組，對(duì)蝦白斑綜合征病毒增殖數(shù)量顯著低于常溫感染組，表明誘導(dǎo)型熱休克蛋白70的抗凋亡作用在高溫抑制對(duì)蝦白斑綜合征中作用不顯著。誘導(dǎo)型熱休克蛋白70和組成型熱休克蛋白70同屬于熱休克蛋白70家族，具有相同的蛋白結(jié)構(gòu)域，已發(fā)現(xiàn)組成型熱休克蛋白70與對(duì)蝦白斑綜合征病毒的VP28直接作用，那么誘導(dǎo)型熱休克蛋白70能否直接與對(duì)蝦白斑綜合征病毒相關(guān)蛋白作用，從而抑制其增殖，有待試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。
結(jié)語
高溫條件下病毒感染引起宿主細(xì)胞的應(yīng)激，具有細(xì)胞毒性作用，激發(fā)了宿主細(xì)胞一系列防御機(jī)制。非特異性免疫系統(tǒng)是對(duì)蝦最基本的防御機(jī)制，但是其作用有限，還需要其他機(jī)制來輔助抵抗應(yīng)激：一是細(xì)胞凋亡的抗病毒作用。當(dāng)病毒感染宿主細(xì)胞后，宿主細(xì)胞的凋亡機(jī)制和病毒的抗凋亡機(jī)制同時(shí)存在，兩者處于一個(gè)相互作用的過程，特別是在病毒感染的初期。二是誘導(dǎo)型熱休克蛋白70作用，高溫和病毒都能夠誘導(dǎo)誘導(dǎo)型熱休克蛋白70表達(dá)來對(duì)抗應(yīng)激，保護(hù)細(xì)胞。雖然誘導(dǎo)型熱休克蛋白70具有抗凋亡作用，但是在高溫感染對(duì)蝦白斑綜合征病毒過程中，以抑制對(duì)蝦白斑綜合征病毒增殖為主，其抑制機(jī)制還尚無定論，需要深入研究誘導(dǎo)型熱休克蛋白70與對(duì)蝦白斑綜合征病毒何種蛋白相互作用關(guān)系，或者還有其他的機(jī)制存在。