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作者：高正勇曾令兵肖漢兵張輝孟彥肖藝徐進單位：中國水產科學研究院長江水產研究所農業部長江流域水生動物疫病重點實驗室湖北武漢

病毒培養及滴度測定

在多個T－25細胞培養瓶中接種EPC細胞，培養至匯合單層，棄去培養液，用無菌的Hank’s液洗滌細胞1次，取細胞培養的GSIV病毒液，以感染復數(MultiplicityofInfection，MOI)為0.5的量接種病毒液于細胞培養瓶中，所接種的病毒液體積為1mL/瓶，加入適量的助感染劑Polybrene(終濃度10μg/mL)，置于25℃培養箱中吸附1h，期間每20min輕輕往復傾斜培養瓶數次，以利于病毒均勻吸附。吸附完畢后吸棄病毒液，每瓶加入5mL細胞維持液(含2%(V/V)血清的MEM培養基)，置于25℃培養箱中培養，逐日觀察細胞病變情況。當細胞單層出現70%～80%細胞病變效應(Cytopathiceffect，CPE)時收獲細胞培養物，－80℃室溫條件下凍融2次，于4℃條件下4000r/min離心20min，收集病毒液上清，進行病毒滴度(TCID50/0.1mL)的測定，然后分裝于凍存管中－80℃保存備用。病毒滴度測定在96孔微量培養板中進行，病毒液用不含血清的MEM培養基10倍梯度稀釋，分別接種于已長滿EPC細胞的96孔微量培養板中，每個稀釋度設8個復孔，每孔100μL，對照組設8孔，每孔加入100μL不含血清的MEM培養基模擬感染。吸附完畢后棄去病毒液，微量培養板中所有細胞孔添加100μL細胞維持液(含2%(V/V)血清的MEM培養基)，于25℃的條件下培養，逐日觀察記錄結果，按Reed－Muench法計算病毒滴度(TCID50/0.1mL)［8］。

病毒理化特性測定

1熱處理試驗

取1.2中制備的細胞培養病毒液3管，實驗組分別置于56℃、65℃水浴中保溫處理30min，對照置于20℃保溫處理30min，然后分別作TCID50測定，設重復(2次)測定試驗。

2酸堿敏感性試驗

取1.2中制備的細胞培養病毒液3管，實驗組分別用HCl(1mol/L)和NaOH(1mol/L)調整其pH值為3.0和10.0，于20℃處理60min后，調節pH值至7.0。對照用不含血清的MEM培養基作相同的處理，然后分別作TCID50測定，設重復(2次)測定試驗。

3有機溶劑敏感性試驗

3.1氯仿敏感性試驗

取1.2中制備的細胞培養病毒液2管，實驗組加入適量氯仿，使其終濃度為4.8%(V/V)，置4℃振蕩10min，然后以3000r/min離心20min，小心吸取上層水相。對照用不含血清的MEM培養基作相同的處理，然后分別作TCID50測定，設重復(2次)測定試驗。

3.2乙醚敏感性試驗

取1.2中制備的細胞培養病毒液2管，實驗組加入適量乙醚，使其終濃度為20%(V/V)，振蕩10min后置4℃下24h，其間搖動數次，然后以3000r/min離心20min，吸取下層病毒液并反復吹打數次使殘留的乙醚揮發，對照用不含血清的MEM培養基作相同的處理，然后分別作TCID50測定，設重復(2次)測定試驗。

4胰蛋白酶敏感性試驗

取1.2中制備的細胞培養病毒液2管，實驗組取病毒懸液1mL加入等量的1%胰蛋白酶(pH值為7.4)搖勻，使胰蛋白酶的終濃度為0.5%(V/V)，置37℃作用60min，隨后加入4mL新生牛血清(已滅活)充分混合以終止胰蛋白酶的作用，對照用不含血清的MEM培養基作相同的處理，然后分別作TCID50測定，設重復(2次)測定試驗。

5凍融次數對病毒滴度的影響

取1.2中制備的細胞培養病毒液6管，于－80℃室溫下分別凍融1次、2次、3次、4次、5次、6次，然后分別在EPC細胞中作TCID50測定，設重復(2次)測定試驗。

病毒的生物學特性測定

1不同來源細胞系的感染試驗

在T－25細胞培養瓶中分別傳代培養EPC、CIK、CCK、RTG－2、CHSE－214、PF－Fin等細胞至匯合單層，以MOI為0.5的量接種1.2中制備的細胞培養病毒液，培養并逐日觀察CPE。7d后收獲病毒，分別在EPC細胞中作TCID50測定，設重復(2次)測定試驗。

2病毒的最適培養溫度

取生長至匯合單層的EPC細胞(T－25細胞培養瓶培養)，以MOI為0.5的量接種1.2中制備的細胞培養病毒液，試驗分為6組，分別于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃條件下培養，逐日觀察CPE。7d后收獲病毒，分別在EPC細胞中作TCID50測定，設重復(2次)測定試驗。

3病毒的繁殖動態

病毒繁殖動態研究參照文獻［10－11］進行。取生長至匯合單層的EPC細胞，以MOI為0.5的量接種1.2中制備的細胞培養病毒液，試驗分為8個組，分別于病毒感染細胞后的2、6、12、24、48、72、84、96h從培養箱中取出一組，于－80℃室溫下凍融2次，4000r/min離心20min除去細胞碎片，分別在EPC細胞中作TCID50測定，設重復(2次)測定試驗。

病毒形態的觀察

傳代培養EPC細胞至匯合單層，接種1.2中制備的細胞培養病毒，待細胞單層出現50%～60%的CPE時，吸出維持液，加入2%(V/V)戊二醛固定液于室溫預固定10min，吸出固定液，再添加4mL固定液于冰上固定10min，然后用細胞刮子將細胞刮下，收集于15mL離心管中，2500r/min離心20min取細胞沉淀。細胞沉淀經漂洗、固定、脫水、滲透、包埋、切片、染色后，在透射電鏡下進行病毒的形態觀察。

統計分析

實驗數據用SPSS13.0進行統計分析，數據均用平均值±標準差(mean±SD)表示，各組數據的差異顯著性采用t檢驗或單因素方差分析(One－WayANOVA)Duncan氏多重比較，顯著性水平為0.05，極顯著性水平為0.01。

結果

1病毒培養情況及滴度

GSIV能在EPC細胞中穩定增殖，滴度TCID50/0.1mL=109.52±0.69。GSIV接種EPC細胞36h，細胞收縮成團、折光度增加，出現病灶，細胞培養液上清中出現死細胞;接種細胞48h，細胞單層出現脫落，呈破魚網狀，呈現出典型CPE(圖1B)。

2病毒的理化特性

GSIV經56℃、65℃兩種溫度條件下處理30min均能使病毒失去感染活性。pH3或pH10處理GSIV60min，與對照組相比病毒滴度分別下降了8.58、9.04個對數級，差異極顯著(P＜0.01)。

有機溶劑－氯仿處理后能使病毒完全失去感染活性，與對照組相比病毒滴度下降了9.33個對數級，差異極顯著(P＜0.01);有機溶劑－乙醚處理，與對照組相比病毒滴度下降了7.83個對數級，差異極顯著(P＜0.01)。胰蛋白酶處理組與對照組相比病毒滴度下降了6.49個對數級，差異極顯著(P＜0.01)(表1)。GSIV于－80℃和室溫條件下凍融1～6次，病毒滴度變化不顯著(P＞0.05)(表2)。

3病毒的生物學特性

3.1對不同來源細胞系的感染作用

GSIV能在EPC、CCK、RTG－2、CHSE－214、CIK等細胞中增殖。但在EPC、CCK細胞中增殖速度較快，2～3d出現典型的CPE，病毒滴度也相對較高。而在RTG－2、CHSE－214、CIK、PF－Fin細胞中增殖速度比較慢，病毒滴度也相對較低(表3)。

3.2GSIV最適培養溫度

GSIV在15～30℃培養條件下均能在EPC細胞中大量增殖并產生CPE，15℃、20℃、25℃、30℃各組之間病毒滴度差異不顯著(P＞0.05)，但以25℃培養條件下EPC細胞出現CPE的時間最短;10℃、35℃培養組均未出現CPE，病毒滴度與25℃培養條件下相比較差異極顯著(P＜0.01)(表3)。

3.3病毒的增殖動態

病毒在EPC細胞中的增殖動態表明:GSIV接種EPC細胞6h后，病毒滴度開始上升，隨后病毒的增殖進入對數生長期，72h時病毒滴度達到最大，以后趨于穩定(圖2)。

病毒的形態

感染GSIV的EPC細胞，經超薄切片，透射電鏡下觀察，發現大量虹彩病毒樣顆粒在細胞質中呈晶格狀排列，病毒粒子呈正六邊形，直徑約140nm。

討論

虹彩病毒(Iridoviruses)是一類胞漿型DNA病毒。虹彩病毒科(Iridoviridae)分為五個屬:綠虹彩病毒屬(Chloriridovirus)、虹彩病毒屬(Iridovir-us)、淋巴囊腫病毒屬(Lymphocystivirus)、腫大細胞病毒屬(Megalocytivirus)和蛙病毒屬(Ranavir-us)。其中綠虹彩病毒屬、虹彩病毒屬感染無脊椎動物;蛙病毒屬、淋巴囊腫病毒屬、腫大細胞病毒屬感染變溫脊椎動物。尤其是蛙病毒屬的一些成員是導致變溫動物發病的一個重要原因，被認為是全球范圍內兩棲類、爬行類數量減少的主要原因。本實驗研究的GSIV對熱、酸、堿、有機溶劑、胰蛋白酶處理敏感，這與江育林等分離到大鯢虹彩病毒及王曉紅等從虎紋蛙(Hoplobatra-chustigerinus)蝌蚪中分離到虹彩病毒的研究結果一致，說明這些理化因子不僅僅破壞了病毒的囊膜，還破壞了病毒粒子的完整性，使其感染能力大大下降。病毒的凍融處理主要破壞病毒的囊膜，本文中GSIV能夠耐受反復的凍融處理，其病毒滴度下降不明顯，表明無囊膜的GSIV病毒粒子仍具有感染性，進一步證實無囊膜病毒粒子仍可通過與細胞膜融合的方式向細胞內注入DNA，進而啟動病毒的復制。

GSIV在EPC、CCK細胞中增殖速度較快，滴度相對較高;在CIK中增殖速度較慢，滴度相對較低。這與王曉紅等研究結果相似，而與江育林等［3］的研究結果有差異，江育林等研究的結果表明，ADIV在BF－2、CO、CHSE－214等細胞中增殖速度較快，滴度相對較高，而在EPC細胞中5d才出現CPE，滴度也相對較低。造成這一差異的原因可能是使用的不同病毒分離株所致，需開展進一步的比較研究。

GSIV在EPC細胞中最適增殖溫度25℃，病毒滴度TCID50/0.1mL=109.52±0.69，這與Ariela等的研究結果基本一致，而與王曉紅等的研究結果有差異。GSIV在EPC細胞中的增殖動態結果表明，病毒接種細胞6h后進入對數生長期，72h時病毒滴度達到最大并趨于穩定，這提示我們收獲病毒的最佳時間。虹彩病毒核衣殼呈二十面體狀，中心為電子致密的中央核心體，周圍為一個六邊形的外殼，在中央核心體和衣殼之間為一層非電子致密區。GSIV感染EPC細胞超薄切片電鏡觀察，病毒粒子呈正六邊形，直徑約140nm，呈典型的虹彩病毒樣特征。