一種優(yōu)良半矮稈水稻品種分離與分子鑒定范文

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摘要:株1S是中國南方稻區(qū)雜交水稻育種廣泛應(yīng)用的優(yōu)良秈型溫敏雄性核不育系.為了改良其農(nóng)藝性狀,我們采用體細(xì)胞無性系誘變方法篩選半矮稈突變體.本文報(bào)道了2個(gè)體細(xì)胞無性系突變體SV1S和SV14S的表型和初步分子鑒定結(jié)果.與親本株1S相比,突變體的高度降低,基部節(jié)間長度縮短,節(jié)間壁顯著增厚,但是上部的節(jié)間變化不明顯.更重要的是,我們發(fā)現(xiàn)赤霉素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因GA20ox-2出現(xiàn)了約200bp的缺失突變,導(dǎo)致該基因在半矮稈突變體中的轉(zhuǎn)錄水平降低.研究結(jié)果表明,突變體SV1S和SV14S很可能是由于同一缺失突變導(dǎo)致赤霉素合成受阻,從而部分導(dǎo)致了半矮稈性狀的出現(xiàn).然而,2個(gè)突變體苗期的高度相同,以及糊粉層細(xì)胞-淀粉酶活性和赤霉素敏感性降低等性狀與以前報(bào)道的sd-1突變體有所不同.因此,我們推測(cè)在SV突變體中可能還存在第二個(gè)突變位點(diǎn).該結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了體細(xì)胞無性系誘變?cè)谒居N中具有良好的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞:GA20ox-2;赤霉素;限制性片段長度多態(tài)性(RFLP);水稻(OryzasativaL.);半矮稈

Abstract:Zhu1Sisaneliteindicathermo-sensitivegenicmale-sterilebreedingstockwidelyusedinhybridriceproductioninSouthernChina.Toimprovekeyagronomictraitsofthiselitecultivar,weusedsomaticmutagenesismethodtoscreenforsemi-paringtotheparentZhu1S,thesemutationsreducedtheplantstatures,shortenedandthickenedthelowerinternodessignificantlybuttheupperinternodesslightly.Furthermore,wefoundanabout200bpdeletionintheGA20ox-2geneencodingthekeyGAmetabolicenzymeandlittletranscriptionofthisgeneinbothsemi-dwarfmutantlines.TheseresultsindicatethatSV1SandSV14Smutantsaremorelikelyimpairedingibberellinmetabolismderivedfromthesamemutationthatispartiallyresponsiblefortheirsemi-dwarfphenotype.Whereas,bothmutantshavesimilarheightattheseedlingstageandreduceslightlyGAsensitivityof-amylaseactivityinaleuronecells,whichisdifferentfromthesd-1mutantsreportedpreviously.Therefore,weguessthatthereisasecond-sitemutationintheSVmutants.Ourresultsfurtherdemonstratedtheusefulnessofusingsomaticmutagenesisinthericebreedingprogram.Keywords:GA20ox-2;gibberellin;restrictionfragmentlengthpolymorphism(RFLP);rice(OryzasativaL.);semi-dwarf矮稈或半矮稈性狀是包括水稻(OryzasativaL.)在內(nèi)的禾谷類作物的重要性狀之一.矮稈或半矮稈作物不僅提高抗倒伏能力,而且不影響穗的育性和結(jié)實(shí)率,從而提高了作物產(chǎn)量[1].眾所周知的導(dǎo)致糧食產(chǎn)量大幅提高的“綠色革命”就是由于培育和大規(guī)模推廣高產(chǎn)的半矮稈水稻品種所帶來的一場作物綠色革命.赤霉素(gibberellin,GA)在調(diào)節(jié)植物的許多生理過程,如種子萌發(fā)、莖的伸長、花和果實(shí)的發(fā)育等方面起著非常重要的作用[2-4].迄今為止,從水稻分離的與赤霉素有關(guān)的突變體被歸為三類:細(xì)長型突變體、GA非敏感型突變體和GA敏感型突變體[5,6].細(xì)長型突變體表現(xiàn)出一種組成型的持續(xù)激活的GA響應(yīng)模式,而矮稈突變體則出現(xiàn)GA生物合成途徑或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的缺失.如細(xì)長型水稻突變體slr1-1是由一個(gè)隱性單基因控制,并導(dǎo)致組成型的GA敏感表型[7].隱性的GA非敏感型矮稈突變體d1是由于其異源三聚體G蛋白的α-亞單位突變,導(dǎo)致GTP結(jié)合蛋白無法傳遞赤霉素信號(hào),使GA不能正常發(fā)揮作用,從而導(dǎo)致極端矮稈性狀,而且外源GA處理不能使莖伸長[8].同時(shí),Ueguchi-Tanaka等[8]在水稻中鑒定了一種赤霉素不敏感的矮化突變體gid1,而GID1過量表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致對(duì)赤霉素超敏感.這些研究結(jié)果表明,赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受阻使得赤霉素對(duì)植株生長發(fā)育的調(diào)節(jié)得不到有效執(zhí)行,從而導(dǎo)致植株矮化.在水稻中,許多GA敏感型矮稈突變體及其相應(yīng)基因已經(jīng)被分離和鑒定.如突變體dx和d18分別為內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶和GA3氧化酶發(fā)生突變,導(dǎo)致體內(nèi)活性GA1的含量降低[9,10].半矮稈突變體sd-1是由于GA20氧化酶-2基因(OsGA20ox-2)突變導(dǎo)致GA20氧化酶-2活性喪失,體內(nèi)活性GA1的含量降低[11-13].該突變性狀增加了抗倒伏能力和產(chǎn)量,廣泛應(yīng)用于水稻育種,被譽(yù)為“綠色革命”.另一個(gè)GA20氧化酶基因(OsGA20ox-1)也已被分離和克隆,發(fā)現(xiàn)特異性抑制該基因表達(dá)可以導(dǎo)致矮化[14].另外,一個(gè)Ds標(biāo)記的水稻敏感型矮稈突變體已被分離,發(fā)現(xiàn)是由于GA合成的第二步催化過程中的內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶(KS)被破壞所致[15].這些結(jié)果表明,赤霉素敏感型矮稈突變體是由于赤霉素生物合成途徑中某一關(guān)鍵酶的活性降低或喪失,從而阻礙了赤霉素的生物合成和代謝,導(dǎo)致內(nèi)源GA含量顯著降低.因此,該突變類型亦稱GA缺陷型矮稈突變體.該類絕大部分突變體呈現(xiàn)明顯的矮化,外施GA可恢復(fù)其正常表型.

株1S是一種中國南方雜交水稻育種廣泛應(yīng)用的優(yōu)良兩系光溫敏雄性核不育系[16].它具有育性轉(zhuǎn)換臨界溫度低、高抗逆性和廣親和性等特點(diǎn).但是其株高偏高,抗倒伏能力差,容易導(dǎo)致雜交后代因倒伏而減產(chǎn).為了改良該農(nóng)藝性狀,采用無性系誘變育種方法選育了優(yōu)良矮化突變株系SV1S和SV14S[17].本研究中,我們從形態(tài)、生理和分子水平對(duì)矮化突變株系SV1S和SV14S進(jìn)行了研究,以期闡明SV突變株系矮化的原因.1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料株1S為湖南省株州市農(nóng)科所培育的秈型光溫敏核不育水稻,SV1S和SV14S為本研究組利用體細(xì)胞無性系變異篩選的半矮稈突變體.另外,2個(gè)粳稻品種日本晴和黃殼糯在Southern雜交實(shí)驗(yàn)中用作對(duì)照.1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1半矮稈突變體的分離從株1S中分離2-3cm長的幼穗,經(jīng)表面消毒后接種于MS+2,4-D2.0mg/L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織.3周后將誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至MS+6-BA0.2mg/L+2,4-D2.0mg/L繼代培養(yǎng).4周后將繼代培養(yǎng)后的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接至MS+2,4-D4.0mg/L培養(yǎng)3周左右,然后轉(zhuǎn)移至MS+6-BA2.0mg/L誘導(dǎo)芽的分化.分化苗再轉(zhuǎn)移至MS+NAA0.5mg/L+IAA0.5mg/L進(jìn)行生根培養(yǎng)2周,待根長好后煉苗1周,最后移栽至大田中.所有組織培養(yǎng)條件為16h光照和8h黑暗,溫度為25±2°C.分化苗(R0)移栽至大田中,抽穗期套袋自花受粉,成熟期單株收種.體細(xì)胞無性系突變體(SV)表型的初步鑒定按文獻(xiàn)[17]的方法在R1和R2代進(jìn)行.1.2.2半矮稈突變體表型的鑒定SV突變體的表型鑒定于R2代進(jìn)行.由于不育狀態(tài)的不育系水稻有旗葉鞘包穗現(xiàn)象,對(duì)植株高度的測(cè)量影響很大[18,19].因此,SV突變體及其親本株1S都必需經(jīng)低溫處理恢復(fù)育性后方能測(cè)量株高和節(jié)間長度.SV突變體及其親本株1S于冬季種植于海南陵水育種基地,利用低溫(20°C左右)恢復(fù)育性,于成熟期測(cè)量株高及各節(jié)間長度.莖的組織解剖學(xué)觀察按照張全芳等[20]的方法進(jìn)行.于抽穗期分別取株1S和SV14S的第IV節(jié)間進(jìn)行石蠟切片,然后于奧林巴斯光學(xué)顯微鏡下觀察并照相.1.2.3外源GA3對(duì)幼苗伸長的影響將種子用0.1%的HgCl2消毒5-6min,蒸餾水沖洗3次后15℃下再浸種24h,放入光照培養(yǎng)箱中35℃催芽24h.等種子露白后再播于盛有蛭石的瓷盤中,30℃培養(yǎng)3天后,分別以7種不同濃度(1×10-10mol/L,1×10-9mol/L,1×10-8mol/L,1×10-7mol/L,1×10-6mol/L,1×10-5mol/L,1×10-4mol/L)的GA3溶液每天澆苗的基部,并以清水澆苗的基部為對(duì)照,直至第一葉停止生長為止,比較播后第6天的第二葉鞘長度.每種材料各個(gè)濃度測(cè)量40株,去掉最高和最矮苗后,測(cè)量38株苗的第二葉鞘長度.另外,測(cè)量播種后第7天的幼苗高度.同樣是每種材料各個(gè)濃度測(cè)量40株,去掉最高和最矮苗后,測(cè)量38株苗的高度.1.2.4外源GA3對(duì)無胚半粒種子α-淀粉酶的誘導(dǎo)參照Ueguchi-Tanaka等[8]的方法準(zhǔn)備無胚半粒種子和α-淀粉酶的誘導(dǎo).首先配制0.2%淀粉-2%瓊脂培養(yǎng)基,高壓蒸汽滅菌.滅菌后,待培養(yǎng)基冷卻至60℃左右,于超凈工作臺(tái)上在部分培養(yǎng)基中加入GA3,至終濃度為10-6mol/L.然后將含GA3和不含GA3培養(yǎng)基分別倒入滅菌培養(yǎng)皿中,冷卻后備用.挑選飽滿水稻種子,去掉穎殼,用70%的酒精滅菌1-2min,0.1%的HgCl2浸泡10-15min,再用無菌水沖洗5次,在無菌條件下將種子切成兩段,挑取無胚半粒段分別均勻地置入含GA3和不含GA3培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿平板中,每培養(yǎng)皿放置6粒種子.30℃培養(yǎng)4天后,加I-KI指示劑到培養(yǎng)皿中,2-3min后傾出I-KI指示劑,用蒸餾水沖洗瓊脂表面,然后觀察種子周圍出現(xiàn)的透明圈,并測(cè)量透明圈的大小.每種材料在不同培養(yǎng)基上共處理30粒種子,即5個(gè)培養(yǎng)皿平板.1.2.5RFLP分析采用CTAB(cetyltrimethylammoniumbromide)法[21]提取葉片基因組DNA.參照Motoyuki等[22]的方法進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性[Restrictionfragmentlengthpolymorphism(RFLP)]分析.基因組DNA(20µg)經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI酶切過夜后,用0.8%(wt/vol)的瓊脂糖凝膠電泳分離,再轉(zhuǎn)移至尼龍膜上.按照Spielmeyer等[12]的方法采用正向引物(5’-GCGCCAATGGGGTAATTAAAACG-3’)和反向引物(5’-GGCATTCCATTGTTTGTGATTGG-3’)從GA20ox-2基因中擴(kuò)增的634bp片段作為雜交用的探針.探針采用α-32P-ATP標(biāo)記.在0.25mol/LNa2HPO4,1.0mmol/LEDTA和7%SDS溶液中于65℃雜交過夜.在2×SSC,0.1%SDS溶液中于65℃洗膜15min,共洗膜2次,然后再于0.2×SSC,0.1%SDS溶液中于65℃洗膜15min.1.2.6序列分析已有研究表明,GA20ox-2基因(GenBankaccessionno.AY114310)有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子,定位于1號(hào)染色體上[11-13].為了得到GA20ox-2的旁鄰序列,以GA20ox-2的序列在基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行了BLAST搜索,結(jié)果在粳稻品種日本晴基因組數(shù)據(jù)庫中搜索到人工細(xì)菌染色體(BAC)克隆AP003561以及秈稻品種9311基因組數(shù)據(jù)庫中搜索到scalffold000946與GA20ox-2的序列相匹配.然后以軟件PrimerPremier5.0分析GA20ox-2基因及其旁鄰序列的HindIII和EcoRI的酶切位點(diǎn).1.2.7GA20ox-2的表達(dá)分析采用TrizonRNA提取試劑盒(Invitrogen)從葉片中提取總RNA.首先采用半定量RT-PCR分析GA20氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄水平.GA20ox-1(GenBankaccessionno.U50333)的半定量RT-PCR引物序列為:正向引物(F)為5’-CGTCACCTGCAACCAACAAT-3’;反向引物(R)為5’-GATGGGTACGTGCAAACCAA-3’.GA20ox-2(GenBankaccessionno.AY114310)的半定量RT-PCR引物序列為:正向引物(F)為5’-TACTACAGGGAGTTCTTCGCGGACAGCA-3’;反向引物(R)為5’-TGTGCAGGCAGCTCTTATACCTCCCGTT-3’.作為內(nèi)參的水稻肌動(dòng)蛋白基因Actin(GenBankaccessionno.X16280)的半定量RT-PCR引物序列為:正向引物(F)為5’-CTGGGTTCGCCGGAGATGAT-3’;反向引物(R)為5’-TGAGATCACGCCCAGCAAGG-3’.

隨后采用熒光定量PCR(QPCR)進(jìn)一步驗(yàn)證GA20氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄水平.QPCR在MX3000熒光定量PCR儀上進(jìn)行,以染料ROX作為參比熒光強(qiáng)度,具體操作步驟見Costa等[23]的方法.GA20ox-2的QPCR引物與半定量RT-PCR一樣,但是GA20ox-1和Actin基因的QPCR引物作了相應(yīng)改變.GA20ox-1的QPCR引物序列為:正向引物(F)為5’-AATGAGCATGGTGGTGCAGCAGGAGCAG-3’;反向引物(R)為5’-GTTAACCACCAGGAAGAAGCCGTGCCTC-3’.Actin的QPCR引物序列為:正向引物(F)為5’-AGTCTGACCCATCCATTGTGC-3’;反向引物(R)為5’-TTGTCCACGCTAATCAAGAAAC-3’.值得說明的是,所有引物都設(shè)計(jì)在相應(yīng)基因cDNA的3’端.2結(jié)果與分析2.1矮稈突變體的分離和表型分析株1S植株偏高,節(jié)間較長,其雜交后代抗倒伏性較差.已有研究表明[24],在植物組織培養(yǎng)中,體細(xì)胞容易產(chǎn)生突變,所以采用體細(xì)胞無性系誘變方法篩選半矮稈突變體,以期降低株1S的高度.通過約2-3個(gè)月的愈傷組織誘導(dǎo)、繼代和分化,得到了24個(gè)具有明顯不同于親本株1S的獨(dú)立分化植株(R0).在R1現(xiàn)2個(gè)突變株系SV1S和SV14S表現(xiàn)出半矮稈性狀,并且其他農(nóng)藝性狀仍然比較優(yōu)良.經(jīng)過R2和R3代的后續(xù)表型分析發(fā)現(xiàn),2個(gè)SV突變株系的半矮稈性狀沒有出現(xiàn)分離,說明通過體細(xì)胞誘變的方法成功獲得了性狀穩(wěn)定的半矮稈突變體.除了植株高度變矮之外,SV1S和SV14S的表型與親本株1S基本沒有差異(圖1).更重要的是,突變體仍然保留了株1S的優(yōu)良性狀,包括光溫敏不育的生理特性(數(shù)據(jù)未列出).圖1顯示了親本株1S和SV突變體的植株形態(tài)和高度.從圖可知,植株高度按株1S,SV14S和SV1S的順序從78.5cm逐漸降低為60.3cm.同時(shí)分析了株1S和SV14S的各節(jié)間長度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與親本株1S相比,SV14S的基部節(jié)間長度明顯縮短,而上部節(jié)間幾乎沒有變化(圖2A和B).該性狀不僅提高了抗倒伏能力,而且有助于產(chǎn)量的增加.另外,進(jìn)一步觀察了位于基部的IV節(jié)間橫切面,發(fā)現(xiàn)SV14S節(jié)間直徑和節(jié)間壁厚度均顯著大于親本株1S(圖2C).結(jié)果說明,突變體SV14S增加了抗倒伏能力,有助于提高產(chǎn)量.2.2SV突變體對(duì)外源GA表現(xiàn)出正常的敏感性赤霉素的一個(gè)重要生理功能是促進(jìn)水稻苗的生長[25,26].為了確定所獲得的半矮稈突變體是否與GA有關(guān),我們檢測(cè)了其GA敏感性特征.在缺乏外源赤霉素時(shí)SV突變體的幼苗和親本株1S高度幾乎相同,而施加外源GA3時(shí)SV突變體的幼苗卻比對(duì)照親本高(圖3A).結(jié)果表明,SV1S和SV14S幼苗對(duì)外源赤霉素表現(xiàn)出正常的敏感性.同時(shí),還研究了外源GA3對(duì)第二葉鞘長度的影響,發(fā)現(xiàn)SV突變體和親本株1S的第二葉鞘均對(duì)不同濃度GA3敏感,其伸長程度都非常相似(圖3B).該結(jié)果進(jìn)一步證明,SV突變體在葉鞘的生長方面也對(duì)GA敏感.另外,還研究了外源赤霉素對(duì)無胚半粒種子α-淀粉酶的誘導(dǎo)特性(圖3C).研究發(fā)現(xiàn),在含GA3的淀粉平板中SV突變體和親本株1S的無胚半粒種子周圍均產(chǎn)生了明顯的暈圈,說明都有α-淀粉酶誘導(dǎo).但是在不含GA3的淀粉平板中SV突變體和株1S都沒有產(chǎn)生暈圈.該結(jié)果表明SV突變體和親本株1S無胚半粒種子的α-淀粉酶都能被外源GA3誘導(dǎo),進(jìn)一步證明了SV突變體對(duì)外源赤霉素敏感,其半矮稈性狀可能是由于活性GA的缺失引起的.然而與親本株1S相比,SV突變體的暈斑數(shù)目較少,暈斑的大小也較小,說明在組織培養(yǎng)過程中SV突變體中可能還有其它與赤霉素合成無關(guān)的基因產(chǎn)生了突變,從而導(dǎo)致在GA敏感性和植株高度方面產(chǎn)生了微小差異.綜合以上生理研究結(jié)果可以得知,SV1S和SV14S矮化性狀不是由于赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑缺失引起的,很可能是由于赤霉素生物合成途徑的缺失或其它突變導(dǎo)致的.2.3SV突變體的GA20ox-2基因中的一段缺失引起該基因的表達(dá)量降低鑒于本研究中SV突變體的表型與已知sd-1突變體非常類似,所以我們采用Spielneyer等[12]的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)方法首先研究了SV突變體的GA20ox-2基因.采用PCR方法從親本株1S的GA20ox-2中克隆了一段長634bp片段作為探針.在RFLP雜交圖譜中,SV突變體和親本株1S間有明顯的譜帶差異(圖4A,B).當(dāng)基因組DAN以限制性內(nèi)切酶HindIII酶切后,親本株1S雜交條帶出現(xiàn)在約4.4kb位置,而SV突變體雜交條帶小約200bp,出現(xiàn)在4.2kb位置(圖4A).該結(jié)果表明在SV突變體GA20ox-2中存在一個(gè)約200bp片段的缺失.另外還發(fā)現(xiàn),2個(gè)野生型粳稻品種日本晴和黃殼糯的雜交條帶出現(xiàn)在4.6kb位置,比秈稻品種株1S雜交條帶大200bp左右.該結(jié)果意味著在秈稻和粳稻GA20ox-2區(qū)域間存在約200bp的差異.當(dāng)基因組DNA以EcoRI酶切后,在野生型對(duì)照品種株1S、日本晴和黃殼糯中均出現(xiàn)2條分別為2.3kb和1.1kb雜交條帶,但是在SV突變體中僅出現(xiàn)一條約3.1kb雜交條帶(圖4B).這些結(jié)果表明在SV突變體GA20ox-2中存在一段約200bp的缺失,并導(dǎo)致GA20ox-2中的一個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)消失.同時(shí),在基因組中也檢測(cè)到了另外一個(gè)GA20氧化酶基因.在RFLP的雜交圖譜中,雜交信號(hào)比較弱的條帶(8kb,圖4A;23kb,圖4B)可能就是另一個(gè)定位在3號(hào)染色體上的GA20氧化酶基因(GA20ox-1;GeneBankaccessionno.U50333)[14].

為了進(jìn)一步驗(yàn)證以上RFLP結(jié)果的可靠性,對(duì)粳稻和秈稻GA20ox-2及其旁鄰序列的HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)進(jìn)行了分析.圖4C顯示了GA20ox-2區(qū)域EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)的限制性圖譜.基于限制性圖譜和所用探針序列的分析,在HindIII酶切的雜交圖譜中預(yù)計(jì)會(huì)出現(xiàn)有4412bp雜交帶,而在EcoRI酶切的雜交圖譜中會(huì)出現(xiàn)2條分別為2376bp和1105bp雜交帶.正如上面所描述的一樣,親本株1S的RFLP研究結(jié)果與預(yù)期結(jié)果完全一致,而SV突變體RFLP結(jié)果與預(yù)期結(jié)果不同.實(shí)際上,通過來自秈稻品種9311的scalffold000946和來自粳稻品種日本晴的BAC克隆AP003561的序列分析發(fā)現(xiàn),在scalffold000946的39371位點(diǎn)有一個(gè)237bp片段的缺失,位于GA20ox-25’端的非編碼區(qū).這個(gè)在秈稻和粳稻間固有的差異導(dǎo)致在HindIII酶切RFLP雜交圖譜中,株1S的雜交條帶比粳稻品種日本晴和黃殼糯小約200bp.所以這個(gè)秈稻和粳稻間固有的237bp差異可以作為陽性對(duì)照,從而推知與親本株1S相比較SV突變體GA20ox-2中存在一個(gè)約200bp的缺失突變.基于以上結(jié)果推知,在2個(gè)SV突變體GA20ox-2中存在約200bp的缺失突變,導(dǎo)致GA20ox-2中4316位點(diǎn)的EcoRI酶切位點(diǎn)消失.根據(jù)Ashikari等人[27]的報(bào)道,已有4個(gè)sd-1等位基因被分離和鑒定出來.一個(gè)來源于低腳烏尖和IR8的sd-1等位基因存在一個(gè)383bp片段缺失,導(dǎo)致了移碼突變而提前產(chǎn)生了終止密碼子.其它3個(gè)分別來源于Jikkoku,Reimei和Calrose76的sd-1等位基因均分別在不同位點(diǎn)出現(xiàn)了點(diǎn)突變,從而造成了一個(gè)氨基酸的改變.在本研究中,SV突變體GA20ox-2中出現(xiàn)了約200bp缺失突變,該突變不同于已報(bào)道的4個(gè)sd-1等位基因,說明該突變基因是一個(gè)新的sd-1等位基因.

另外,還分析了GA20氧化酶基因GA20ox-1和GA20ox-2在親本株1S和SV突變體間的表達(dá)差異(圖5).首先通過半定量RT-PCR分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)GA20ox-1在株1S,SV1S和SV14S中都有很高的表達(dá)量,而在親本株1S和突變體SV1S,SV14S間卻沒有明顯差異.相反,GA20ox-2在突變體SV1S和SV14S中表達(dá)量很低,而在親本株1S中表達(dá)量較高.隨后QPCR分析也得到了同樣的結(jié)果,進(jìn)一步證實(shí)了GA20ox-2在親本和突變體SV1S,SV14S間的表達(dá)差異性(圖5B,C).綜合以上結(jié)果,我們認(rèn)為SV突變體GA20ox-2的缺失突變?cè)斐闪嗽摶虮磉_(dá)量的降低,使植株體內(nèi)活性赤霉素含量減少而導(dǎo)致矮稈性狀.3討論體細(xì)胞無性系誘變經(jīng)常在生產(chǎn)中用于改良作物品種.本研究獲得的2個(gè)變突變體具有不同的半矮稈表型,其中SV14S保留了親本株1S的大多數(shù)優(yōu)良農(nóng)藝性狀[17],表明SV14S是一個(gè)理想的半矮稈光溫敏不育系,將來在水稻雜交育種中很有可能取代親本株1S,具有很高的應(yīng)用價(jià)值.該優(yōu)良突變體的成功誘變和篩選充分說明了體細(xì)胞無性系誘變具有比較溫和的突變特性,能夠被用于改良在生產(chǎn)中具有很高品質(zhì)和商業(yè)價(jià)值但是又具有某種不良性狀的水稻品種,從而培育出更為優(yōu)良的新品種.迄今為止,在水稻中已經(jīng)有超過60個(gè)矮稈突變體被分離和鑒定出來,并且把它們歸為了赤霉素缺陷型矮稈突變體、赤霉素非敏感型矮稈突變體和其他原因造成的矮稈突變體[29].例如,突變體dx,d18和sd-1是赤霉素合成途徑的缺陷導(dǎo)致活性赤霉素GA1含量降低而造成矮稈[9,10].突變體d1和gid1在赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中出現(xiàn)缺陷而導(dǎo)致對(duì)赤霉素表現(xiàn)出不敏感而造成矮稈[8].突變體d61和d2已分別被確認(rèn)為是在油菜素內(nèi)酯(BR)信號(hào)受體和油菜素內(nèi)酯生物合成途徑的基因發(fā)生突變而導(dǎo)致矮稈性狀[8,27].赤霉素GA20氧化酶是赤霉素生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶,它催化一系列的氧化反應(yīng)并消除C-20,為催化GA合成途徑最后一步反應(yīng)的酶GAβ-羥基化酶(GA3ox)提供底物[30].在水稻中,編碼GA20氧化酶的2個(gè)基因GA20ox-1和GA20ox-2已經(jīng)被鑒定出來.其中特異性抑制GA20ox-1的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致植株高度的矮化[9,14].更重要的是,被譽(yù)為“綠色革命基因”的GA20ox-2功能的缺失而造成的sd-1矮稈突變體也被分離和鑒定出來[11-13].迄今為止,已有4個(gè)sd-1的等位基因被分離和鑒定.一個(gè)來源于低腳烏尖和IR8的sd-1等位基因存在一個(gè)383bp片段的缺失,導(dǎo)致了移碼突變而提前產(chǎn)生了終止密碼子.其他3個(gè)分別來源于Jikkoku,Reimei和Calrose76的sd-1等位基因均分別在不同位點(diǎn)出現(xiàn)了點(diǎn)突變,從而造成了一個(gè)氨基酸的改變,從而導(dǎo)致所編碼的GA20氧化酶部分功能的缺失.在本研究中,SV突變體GA20ox-2基因中出現(xiàn)了約200bp缺失突變,該突變不同于已報(bào)道的4個(gè)sd-1等位基因,因此說明該突變基因是一個(gè)新的sd-1等位基因.植株高度,特別是半矮稈性狀,經(jīng)常被認(rèn)為是一個(gè)數(shù)量性狀,受到多種遺傳因素的影響.在研究中,發(fā)現(xiàn)2個(gè)SV突變體在GA20ox-2基因中都存在約200bp缺失,說明2個(gè)突變體最初來源于組織培養(yǎng)中的同一個(gè)突變細(xì)胞.然而,2個(gè)突變株系在植株高度和α-淀粉酶對(duì)外源赤霉素敏感性方面又存在差異,這意味著在愈傷組織的繼代、分化和突變株的分離篩選過程中2個(gè)突變株系間還有另外一個(gè)微效基因發(fā)生了突變.與親本株1S相比,盡管SV突變體在GA20ox-2基因中出現(xiàn)了約200bp缺失突變,導(dǎo)致該基因表達(dá)量降低,而且在成熟期表現(xiàn)出明顯的半矮稈性狀.但是,在幼苗期當(dāng)缺乏外源赤霉素時(shí),親本株1S和SV突變體都具有相同的植株高度,而且SV突變體在水稻種子糊粉層α-淀粉酶的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中還表現(xiàn)出了對(duì)外源赤霉素敏感性的降低.這些生理性狀均與已報(bào)道的sd-1突變體有所不同[11-13].因此,我們猜想在SV突變體中還存在另一個(gè)突變位點(diǎn),使得SV突變體與所報(bào)道的sd-1突變體有所差異.目前,我們從SV14S與一個(gè)高稈秈稻恢復(fù)系ZR02的雜交后代中篩選到了一個(gè)新型半矮稈光溫敏雄性不育系湘陵628S.該品種已經(jīng)通過了湖南省品種審定,被確認(rèn)為超級(jí)雜交早稻的優(yōu)良母本.與我們所預(yù)期的結(jié)果一樣,湘陵628S株高72cm左右,并且發(fā)現(xiàn)在該突變體中因?yàn)殡s交而丟失了GA20ox-2突變位點(diǎn),恢復(fù)為正常GA20ox-2,從而使得其株高高于母本SV14S,而矮于“祖母”株1S.這進(jìn)一步證實(shí)了可能存在的另一個(gè)突變位點(diǎn)造成了湘陵628S的株高與其母本SV14S和“祖母”株1S間的差異.當(dāng)前,我們正在對(duì)湘陵628S中的突變位點(diǎn)進(jìn)行圖譜定位和克隆,以期進(jìn)一步了解該突變株系的矮稈突變分子機(jī)制.參考文獻(xiàn):[1]BORLAUGNE.Contributionofconventionalplantbreedingtofoodproduction[J].Science,1983,219:689-693.[2]GOMIK,MATSUOKAM.Gibberellinsignallingpathway[J].CurrentOpinioninPlantBiology,2003,6:489-493.[3]CHHUNT,KOICHIROA,KENJIA,etal.Gibberellinregulatespollenviabilityandpollentubegrowthinrice[J].PlantCell,2007,19:3876-3888.[4]袁小川,楊遠(yuǎn)柱,劉選明,等.雄性核不育水稻矮稈突變體突變分子機(jī)制的初步研究[J].生命科學(xué)研究,2005,9(2):141-144(InChinese).YUANXiao-chuan,YANGYuan-zhu,LIUXuan-ming,etal.Apreliminarystudyonthemutationalmechanismofgenicmale-sterilericedwarfingmutants[J].LifeScienceResearch,2005,9(2):141-144.[5]HOOLEYR.Gibberellins:perception,transductionandresponses[J].PlantMolecularBiology,1994,26:1529-1555.[6]SWAINSM,OLSZEWSKINE.Geneticanalysisofgibberellinsignaltransduction[J].PlantPhysiology,1996,112:11-17.

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