測序技術(shù)的應(yīng)用影響分析范文

本站小編為你精心準(zhǔn)備了測序技術(shù)的應(yīng)用影響分析參考范文，愿這些范文能點(diǎn)燃您思維的火花，激發(fā)您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

DNA測序技術(shù)是分子生物學(xué)研究中最常用的技術(shù)，以應(yīng)用DNA雙脫氧鏈終止法的Sanger測序?yàn)榇淼牡谝淮鷾y序技術(shù)，在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮過重要的作用［1］，如人類基因組計劃（Humangenomeproject，HGP）的完成就是基于第一代測序技術(shù)［2］。目前，應(yīng)用該技術(shù)的美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（AppliedBiosystems，ABI）3730系列全自動測序儀仍然被廣泛使用。伴隨著基因組和后基因組時代的來臨，第一代測序儀已經(jīng)不能滿足深度測序和重復(fù)測序等大規(guī)模核酸測序的需求，這就促使自2005年以來誕生了以Roche／454GenomeSe－quencerFLXSystem、Illumina／SolexaGenomeAnalyzerIIx和ABISOLIDSystem等測序平臺為標(biāo)志的新一代測序技術(shù)。新一代測序技術(shù)又稱為深度測序技術(shù)，其最主要的特征是高通量測序，測序時間和成本都顯著降低［3］。本文對新一代測序技術(shù)的基本情況、主要應(yīng)用以及對作物分子育種的影響等三個方面進(jìn)行重點(diǎn)闡述。

1新一代測序技術(shù)的基本情況

基于不同創(chuàng)新方法的各種新一代測序平臺，盡管從模板文庫構(gòu)建、片段擴(kuò)增到測序等過程所采用的技術(shù)與生物化學(xué)相當(dāng)多樣，但是共同點(diǎn)是均采用了大規(guī)模矩陣結(jié)構(gòu)的微陣列分析技術(shù)，其測序的核心思想是邊合成邊測序（Sequencingbysynthesis，SBS）或者邊連接邊測序（Sequencingbyligation，SBL）。首先將片段化的DNA雙鏈兩側(cè)連上接頭，隨后變性得到的單鏈固定在固體表面，運(yùn)用微乳滴PCR（EmulsionPCR，emPCR）、橋式PCR等不同方法產(chǎn)生幾百萬個克隆陣列，然后利用聚合酶或連接酶進(jìn)行延伸反應(yīng)。生成DNA互補(bǔ)鏈時，加入的dNTP通過酶促級聯(lián)反應(yīng)催化底物激發(fā)出熒光，或者直接加入被熒光標(biāo)記的dNTP或半簡并引物，在合成或連接生成互補(bǔ)鏈時，釋放出熒光信號。通過成像檢測系統(tǒng)捕獲光信號并轉(zhuǎn)化為一個測序峰值，獲得互補(bǔ)鏈序列信息。由于所有的克隆都在同一平面上，這些反應(yīng)就能夠大規(guī)模平行進(jìn)行，每個延伸反應(yīng)所摻入的熒光標(biāo)記的成像檢測也能同時進(jìn)行。DNA序列延伸和成像檢測不斷循環(huán)，最后經(jīng)過計算機(jī)分析就可以獲得待測DNA片段的序列信息。

1．1Roche／454測序平臺454生命科學(xué)公司是新一代測序技術(shù)的奠基者，最早推出了劃時代的新型高通量基因組測序系統(tǒng)———GenomeSequencer20System，這一技術(shù)的建立開創(chuàng)了邊合成邊測序（Sequencingbysynthe－sis，SBS）的先河，利用微乳滴PCR實(shí)現(xiàn)DNA片段的擴(kuò)增，光學(xué)信號的產(chǎn)生基于焦磷酸測序法［4－5］。之后，454公司被羅氏診斷公司（RocheInc．）收購，測序儀經(jīng)過改造升級，相繼推出GSFLXSystem和GSFLX＋System。為適合規(guī)模較小的實(shí)驗(yàn)室，Roche／454還推出初級版的新一代測序儀GSJun－iorSystem。目前，最新的Roche454GSFLX＋System最長讀長能達(dá)到1kb，平均讀長700bp。相對其他公司開發(fā)的新一代測序儀，Roche／454測序儀的突出優(yōu)勢是較長的測序讀長，但是測序價格比較昂貴。對于那些要求較長讀長的應(yīng)用，如復(fù)雜基因組的從頭測序項(xiàng)目，Roche／454測序儀是最理想的選擇。

1．2Illumina／Solexa測序平臺Illumina公司的新一代測序儀最早由Solexa公司研發(fā)，基于邊合成邊測序（Sequencingbysyn－thesis，SBS）的思想，利用其專利核心技術(shù)“DNA簇”和“可逆性末端終結(jié)（Reversibleterminator）”，實(shí)現(xiàn)自動化樣本制備和大規(guī)模平行測序，其文庫片段的擴(kuò)增是通過橋式PCR來實(shí)現(xiàn)［5］。Illumina公司收購了Solexa，目前推出多種型號，滿足各種需求的測序儀，按測序產(chǎn)量的多少排序?yàn)镠iSeq2000（600Gb）、HiSeq1000（300Gb）、HiScanSQ（150Gb）、GenomeAnalyzerIIx（95Gb）、MiSeq（＞1Gb）。數(shù)據(jù)產(chǎn)量最大的HiSeq2000測序系統(tǒng)的末端配對讀長可達(dá)到2×100bp，雖然在讀長上比Roche／454測序儀短，但是由于運(yùn)行成本低廉，數(shù)據(jù)讀取量大，Illumina／Solexa測序儀是性價比較高的新一代測序平臺，已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。

1．3ABISOLID測序平臺美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（AppliedBiosystems，ABI）的3730系列全自動測序儀在第一代測序方面一直占據(jù)著重要地位。新一代測序技術(shù)出現(xiàn)以后，ABI公司推出SOLiD新一代測序平臺，并且不斷進(jìn)行改進(jìn)，如今升級到SOLiD5500xlSystem。與Roche／454測序儀相似，ABISOLID測序平臺也是通過微乳滴PCR擴(kuò)增DNA模板，該平臺的獨(dú)特之處在于堿基測序過程中沒有采用傳統(tǒng)的聚合酶延伸反應(yīng)，而是以四色熒光標(biāo)記寡核苷酸的連續(xù)連接反應(yīng)為基礎(chǔ)［5］。SOLiD測序過程中的連接反應(yīng)沒有DNA聚合酶合成過程中常有的錯配問題，再加上SOLiD特有的“雙堿基編碼技術(shù)”又提供一個糾錯機(jī)制，這種設(shè)計上對每個堿基判讀2次的優(yōu)勢使得SOLiD在系統(tǒng)準(zhǔn)確性上大大領(lǐng)先于其他新一代測序平臺，SOLiD5500系統(tǒng)準(zhǔn)確性達(dá)到99．99％。該測序平臺的主要缺點(diǎn)是序列讀長相對較短，目前SOLiD5500系統(tǒng)最大測序讀長為75bp，末端配對讀長為75bp×35bp。

1．4其他新一代測序平臺HelicosBiosciences公司開發(fā)的HeliScopeSingleMoleculeSequencer，原理是“單分子測序”，仍然基于邊合成邊測序；但是不同于以上3種測序平臺，不需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增構(gòu)建單鏈DNA測序文庫，它采用了一種非常靈敏的熒光捕獲系統(tǒng)，能夠直接檢測到一個單分子所釋放的熒光信號［6］。目前，HeliScopeSingleMoleculeSequencer的序列讀長范圍是25bp到55bp，平均讀長是35bp。Heli－ScopeSingleMoleculeSequencer避免了PCR擴(kuò)增而引入的不確定因素，同時所消耗的試劑量大大降低，有利于控制成本；但是該平臺測序準(zhǔn)確度明顯較低，主要是缺失錯誤。而經(jīng)過改造后，在第一輪測序結(jié)束，通過加熱解鏈去掉延伸鏈，可以對同一模板從相反的方向進(jìn)行二輪測序，這樣顯著提高了準(zhǔn)確率。另一種單分子測序平臺是PacificBiosciences公司開發(fā)的單分子實(shí)時技術(shù)（Singlemoleculerealtime，SMRT），其單分子的熒光探測依賴于一種被稱為零級波導(dǎo)（Zeromodewaveguide，ZMW）的納米結(jié)構(gòu)來實(shí)時觀察DNA聚合和消除背景熒光干擾［7］。單分子實(shí)時技術(shù)與HeliScopeSingleMole－culeSequencer平臺一樣，提高原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率是一個挑戰(zhàn)，不過同樣可以通過對同一樣品進(jìn)行重置后的多輪測序來降低錯誤率，而且該平臺在長序列產(chǎn)出、高速測序和低成本等方面具有巨大優(yōu)勢。

2新一代測序技術(shù)的主要應(yīng)用

隨著新一代測序技術(shù)商業(yè)化平臺的不斷推出，由于其在基因組學(xué)研究方面具有低廉的價格、高通量的數(shù)據(jù)、簡易的樣品處理過程等優(yōu)點(diǎn)，生物科學(xué)家已開始越來越多地應(yīng)用新一代測序技術(shù)來解決相關(guān)生物學(xué)問題。

2．1全基因組從頭測序（denovosequencing）對于基因組序列未知的物種，可以應(yīng)用新一代測序系統(tǒng)對其基因組進(jìn)行從頭測序，通過拼接組裝，從而獲得該物種的基因組序列圖譜。Huang等［8］通過聯(lián)合運(yùn)用Sanger測序技術(shù)和Illumina／SolexaGenomeAnalyzer測序平臺繪制了黃瓜基因組草圖，得到平均72．2倍覆蓋度的基因組序列，其中3．9倍是用Sanger技術(shù)得到的，68．3倍是用Illumina／SolexaGenomeAnalyzer測序平臺得到的。Wang等［9］利用Illumina／SolexaGenomeAn－alyzerⅡ測序儀對白菜基因組進(jìn)行測序，產(chǎn)生72倍覆蓋度的成對短序列，組裝得到283．8Mb基因組序列，覆蓋基因序列98％以上，預(yù)測基因大約42000個，發(fā)現(xiàn)白菜基因組中存在3個類似但基因密度明顯不同的亞基因組，推測白菜基因組在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了2次全基因組復(fù)制事件與2次基因丟失過程，還發(fā)現(xiàn)在基因組發(fā)生復(fù)制之后，與器官形態(tài)變異有關(guān)的生長素相關(guān)基因發(fā)生了顯著的擴(kuò)增，這可能是白菜類蔬菜具有豐富根莖葉形態(tài)變異的根本原因。相對于傳統(tǒng)的Sanger測序技術(shù)，采用新一代測序技術(shù)實(shí)現(xiàn)全基因組的從頭測序，從根本上改變著解析生物基因組的方式，其強(qiáng)大的數(shù)據(jù)產(chǎn)出能力，顯著提高了基因組測序效率，急劇降低了成本，使得對任意物種進(jìn)行全基因組測序成為現(xiàn)實(shí)。目前，一大批重要作物的全基因組正在應(yīng)用新一代測序技術(shù)進(jìn)行測序，包括基因組復(fù)雜的油菜和棉花等。

2．2全基因組重測序（Resequencing）在某物種參考基因組序列已知的前提下，新一代測序平臺能高效率地完成該物種不同群體或個體的全基因組測序，從而進(jìn)行基因組序列的差異化分析。由于新一代測序技術(shù)的高通量、大規(guī)模、低成本，所以物種基因組重測序迅速得到推廣，應(yīng)用前景廣闊。Lai等［10］對6個玉米骨干自交系進(jìn)行了全基因組重測序，每個自交系平均測序深度約5．4倍，分析發(fā)現(xiàn)100多萬個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)和3萬多個插入缺少多態(tài)性位點(diǎn)，以及101個低多態(tài)性序列區(qū)段，這些區(qū)段內(nèi)含有大量在選擇過程中與玉米自交系優(yōu)良性狀有關(guān)的候選基因，同時還鑒定出數(shù)百個基因在自交系之間有存在與丟失的多態(tài)變化，這種基因存在與丟失多態(tài)性和其他有害突變的互補(bǔ)作用可能與雜種優(yōu)勢有關(guān)。Huang等［11］通過對517個水稻地方品種的全基因組測序鑒定出約360萬個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，并構(gòu)建了高密度的水稻單體型圖譜（HapMap），然后利用373個秈稻品種群體對株型、產(chǎn)量、子粒品質(zhì)、著色和生理特征等14個農(nóng)藝性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果鑒定的位點(diǎn)可解釋約36％的表型變異，其中有6個位點(diǎn)的峰值信號與之前鑒定的農(nóng)藝性狀基因緊密連鎖，該研究為水稻遺傳學(xué)研究和育種提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)資源。Xu等［12］利用40個水稻栽培品系和10個野生稻材料進(jìn)行15倍覆蓋度以上的全基因組重測序，獲得約650萬個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，80多萬個插入缺失突變和9萬多個結(jié)構(gòu)變異以及1676個拷貝數(shù)變異，基于這些數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)數(shù)千個在水稻馴化過程中與人工選擇有關(guān)的基因，這些基因可能與水稻相關(guān)農(nóng)藝性狀有重要的相關(guān)性。應(yīng)用新一代測序平臺，通過對不同目的材料的全基因組重測序可以實(shí)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型的檢測［11，13］、不同群體間進(jìn)化分析和表型變異相關(guān)基因的發(fā)掘［12，14－15］、突變基因位點(diǎn)的快速定位［16］等。

2．3RNA測序把高通量測序技術(shù)應(yīng)用到由mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA測序上，從而獲得特定樣品中基因mR－NA片段的信息，這就是RNA測序。根據(jù)采用的測序策略不同，RNA測序分為表達(dá)標(biāo)簽測序（Tag－Seq）［17］和轉(zhuǎn)錄組測序（RNA－Seq）［18］。表達(dá)標(biāo)簽測序（Tag－Seq）策略的原理是一個轉(zhuǎn)錄本3＇端特定位置21bp（CATG＋17bp）的標(biāo)簽可以特異性地代表該基因。首先采用2種特殊的限制性核酸內(nèi)切酶NlaIII和MmeI制備標(biāo)簽文庫（Taglibrary），然后利用深度測序技術(shù)獲得所有標(biāo)簽的序列信息，最后將這些標(biāo)簽與參考基因序列數(shù)據(jù)庫比對，得到樣品中基因的表達(dá)情況。每個基因的表達(dá)量來源于其對應(yīng)的標(biāo)簽數(shù)量，相對于傳統(tǒng)的基于核酸雜交的基因芯片技術(shù)，標(biāo)簽測序技術(shù)不需要預(yù)先針對已知基因序列設(shè)計探針，結(jié)果能夠提供更為準(zhǔn)確的數(shù)字化信號，而且檢測通量更高、范圍更廣［19］。Wang等［20］應(yīng)用標(biāo)簽測序技術(shù)研究了徐州142和其無絨突變體在棉花纖維發(fā)育起始階段和纖維伸長階段胚珠的基因表達(dá)譜，基因差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)在野生型和突變體對應(yīng)時期的比較中表達(dá)基因的種類和數(shù)量都明顯不同，而且重點(diǎn)分析了表達(dá)差異倍數(shù)最大的前20個基因，涉及纖維素合成、磷脂酶及脫氫酶等。Wang等［20］還分析了已經(jīng)功能驗(yàn)證的與纖維發(fā)育有關(guān)的基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因理論表達(dá)模式與表達(dá)譜分析結(jié)果一致，充分證明標(biāo)簽測序技術(shù)的準(zhǔn)確性，與前人利用基因芯片技術(shù)的結(jié)果相比較，標(biāo)簽測序獲得數(shù)字基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)在分析深度和范圍上都明顯改善。轉(zhuǎn)錄組測序（RNA－Seq）是通過新一代高通量測序技術(shù)對片段化mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA進(jìn)行測序，利用拼接并統(tǒng)計相關(guān)序列測序次數(shù)，獲得不同轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的表達(dá)信息。轉(zhuǎn)錄組測序是目前深入研究全轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的強(qiáng)大工具，可以研究任意物種的特定狀態(tài)下所有基因轉(zhuǎn)錄本的豐度信息，以及發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本、可變剪接體和檢測單核苷酸多態(tài)性等。Zhang等［21］第一次應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對栽培水稻的8個不同組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平分析，發(fā)現(xiàn)了一大批以前技術(shù)未發(fā)現(xiàn)的新轉(zhuǎn)錄本，可變剪接分析表明33％的水稻基因存在順式剪接，另外鑒定出由于反式剪接產(chǎn)生的234個轉(zhuǎn)錄本，這些結(jié)果證明水稻轉(zhuǎn)錄調(diào)控比以前預(yù)測要復(fù)雜得多。這一結(jié)論在另一模式植物擬南芥中也被證實(shí)，F(xiàn)ilichkin等［22］通過相同的方法，發(fā)現(xiàn)至少42％的含有內(nèi)含子的基因在擬南芥中有可變剪接，這一數(shù)據(jù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以前基于cDNA／EST測序方法的估計值。Graham等［23］利用Roche454測序平臺對青蒿材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定關(guān)鍵基因和分子標(biāo)記，然后構(gòu)建了一張青蒿遺傳圖譜，定位了與青蒿素產(chǎn)量有關(guān)的數(shù)量性狀基因位點(diǎn)（QTL）。

2．4其他應(yīng)用基于新一代測序技術(shù)的小分子RNA測序（SmallRNAsequencing），通過分離特定大小的RNA分子進(jìn)行高通量測序，能夠一次性獲得數(shù)百萬條小分子RNA序列，可以快速定性和定量地鑒定某種組織或細(xì)胞群在特定狀態(tài)下的幾乎所有小分子RNA。應(yīng)用小分子RNA測序方法能分析不同樣品中的小分子RNA差異表達(dá)，鑒定新的小分子RNA并預(yù)測其靶基因。Wang等［24］利用陸地棉品種徐州142及其無纖維無短絨突變體的胚珠作為材料，發(fā)現(xiàn)7個纖維起始相關(guān)的miRNA，并明確了其作用的靶基因，另外還鑒定出36個新的棉花miRNA。小分子RNA測序還可以與轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)相結(jié)合，綜合分析mRNA和小RNA的表達(dá)模式，研究小RNA與其靶基因表達(dá)的相關(guān)性［25］。高通量測序技術(shù)與染色體免疫共沉淀技術(shù)（Chromatinimmunoprecipitation，ChIP）結(jié)合，即ChIPSequencing，通過采用特異性抗體免疫沉淀目的蛋白質(zhì)，富集目的蛋白質(zhì)所結(jié)合的基因組DNA片段并在高通量測序平臺上測序，從而檢測到目的蛋白在基因組中的結(jié)合位點(diǎn)，全面分析蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。Kaufmann等［26］成功將該技術(shù)應(yīng)用在對擬南芥轉(zhuǎn)錄因子SEPALLATA3在基因組中結(jié)合位點(diǎn)的研究。DNA甲基化是非常重要的表觀遺傳修飾方式，基于新一代測序技術(shù)的亞硫酸氫鹽（Bisulfite）處理測序技術(shù)是分析全基因組DNA甲基化的有效手段，Lister等［27］就通過該技術(shù)獲得了擬南芥野生型與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶突變體的全基因組甲基化圖譜。

3新一代測序技術(shù)對作物分子育種的影響

新一代測序技術(shù)的出現(xiàn)，催生了一批新的基因組學(xué)和“后基因組學(xué)”研究手段，使遺傳學(xué)研究產(chǎn)生了革命性進(jìn)步，呈現(xiàn)出全新的面貌。基于新一代測序技術(shù)的基因組水平上的全基因組測序、重測序方法和轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)譜分析、轉(zhuǎn)錄組測序以及研究轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的小RNA測序等分析方法使科研工作者對作物生長發(fā)育過程各種生理生化機(jī)制的探索上升到基因組水平，從而對作物分子生物學(xué)和品種遺傳改良帶來深遠(yuǎn)影響。更多的基因組未測序物種應(yīng)用新一代測序平臺高效率、低成本地完成全基因的從頭測序，豐富核酸序列和基因資源，為進(jìn)一步開發(fā)分子標(biāo)記、挖掘重要功能基因和解析生長發(fā)育機(jī)制等分子生物學(xué)研究提供重要基礎(chǔ)和依據(jù)。通過全基因組重測序，可以完成檢測單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因的分型、不同群體間進(jìn)化分析和表型變異相關(guān)基因的發(fā)掘、快速定位突變基因位點(diǎn)等。基于新一代測序技術(shù)的大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法，相對于基因芯片技術(shù)，以其高通量和定量信息更準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，被迅速地廣泛應(yīng)用，大量實(shí)驗(yàn)證明這些方法是分離候選目的基因和研究目標(biāo)性狀形成或特定生理發(fā)育過程分子機(jī)制的有效途徑。總的來說，分子標(biāo)記的開發(fā)、遺傳圖譜的構(gòu)建、功能基因的分離以及遺傳機(jī)制的闡明等，極大地豐富分子標(biāo)記輔助選擇育種、轉(zhuǎn)基因育種和分子設(shè)計育種的利用資源，顯著促進(jìn)種質(zhì)資源的挖掘與利用效率，大大縮短育種年限和降低成本投入。目前已有報道，通過對玉米骨干自交系進(jìn)行全基因組重測序探究雜種優(yōu)勢機(jī)理［10］，在水稻育種方面，新一代測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于發(fā)掘與重要農(nóng)藝性狀有關(guān)基因［11－12］。可以預(yù)見，隨著技術(shù)方法的不斷創(chuàng)新，新一代測序技術(shù)必將促進(jìn)作物分子育種的快速發(fā)展，使利用功能基因組學(xué)進(jìn)行分子設(shè)計育種逐步成為現(xiàn)實(shí)。