測序技術的應用影響分析范文

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DNA測序技術是分子生物學研究中最常用的技術，以應用DNA雙脫氧鏈終止法的Sanger測序為代表的第一代測序技術，在分子生物學研究領域發揮過重要的作用［1］，如人類基因組計劃（Humangenomeproject，HGP）的完成就是基于第一代測序技術［2］。目前，應用該技術的美國應用生物系統公司（AppliedBiosystems，ABI）3730系列全自動測序儀仍然被廣泛使用。伴隨著基因組和后基因組時代的來臨，第一代測序儀已經不能滿足深度測序和重復測序等大規模核酸測序的需求，這就促使自2005年以來誕生了以Roche／454GenomeSe－quencerFLXSystem、Illumina／SolexaGenomeAnalyzerIIx和ABISOLIDSystem等測序平臺為標志的新一代測序技術。新一代測序技術又稱為深度測序技術，其最主要的特征是高通量測序，測序時間和成本都顯著降低［3］。本文對新一代測序技術的基本情況、主要應用以及對作物分子育種的影響等三個方面進行重點闡述。

1新一代測序技術的基本情況

基于不同創新方法的各種新一代測序平臺，盡管從模板文庫構建、片段擴增到測序等過程所采用的技術與生物化學相當多樣，但是共同點是均采用了大規模矩陣結構的微陣列分析技術，其測序的核心思想是邊合成邊測序（Sequencingbysynthesis，SBS）或者邊連接邊測序（Sequencingbyligation，SBL）。首先將片段化的DNA雙鏈兩側連上接頭，隨后變性得到的單鏈固定在固體表面，運用微乳滴PCR（EmulsionPCR，emPCR）、橋式PCR等不同方法產生幾百萬個克隆陣列，然后利用聚合酶或連接酶進行延伸反應。生成DNA互補鏈時，加入的dNTP通過酶促級聯反應催化底物激發出熒光，或者直接加入被熒光標記的dNTP或半簡并引物，在合成或連接生成互補鏈時，釋放出熒光信號。通過成像檢測系統捕獲光信號并轉化為一個測序峰值，獲得互補鏈序列信息。由于所有的克隆都在同一平面上，這些反應就能夠大規模平行進行，每個延伸反應所摻入的熒光標記的成像檢測也能同時進行。DNA序列延伸和成像檢測不斷循環，最后經過計算機分析就可以獲得待測DNA片段的序列信息。

1．1Roche／454測序平臺454生命科學公司是新一代測序技術的奠基者，最早推出了劃時代的新型高通量基因組測序系統———GenomeSequencer20System，這一技術的建立開創了邊合成邊測序（Sequencingbysynthe－sis，SBS）的先河，利用微乳滴PCR實現DNA片段的擴增，光學信號的產生基于焦磷酸測序法［4－5］。之后，454公司被羅氏診斷公司（RocheInc．）收購，測序儀經過改造升級，相繼推出GSFLXSystem和GSFLX＋System。為適合規模較小的實驗室，Roche／454還推出初級版的新一代測序儀GSJun－iorSystem。目前，最新的Roche454GSFLX＋System最長讀長能達到1kb，平均讀長700bp。相對其他公司開發的新一代測序儀，Roche／454測序儀的突出優勢是較長的測序讀長，但是測序價格比較昂貴。對于那些要求較長讀長的應用，如復雜基因組的從頭測序項目，Roche／454測序儀是最理想的選擇。

1．2Illumina／Solexa測序平臺Illumina公司的新一代測序儀最早由Solexa公司研發，基于邊合成邊測序（Sequencingbysyn－thesis，SBS）的思想，利用其專利核心技術“DNA簇”和“可逆性末端終結（Reversibleterminator）”，實現自動化樣本制備和大規模平行測序，其文庫片段的擴增是通過橋式PCR來實現［5］。Illumina公司收購了Solexa，目前推出多種型號，滿足各種需求的測序儀，按測序產量的多少排序為HiSeq2000（600Gb）、HiSeq1000（300Gb）、HiScanSQ（150Gb）、GenomeAnalyzerIIx（95Gb）、MiSeq（＞1Gb）。數據產量最大的HiSeq2000測序系統的末端配對讀長可達到2×100bp，雖然在讀長上比Roche／454測序儀短，但是由于運行成本低廉，數據讀取量大，Illumina／Solexa測序儀是性價比較高的新一代測序平臺，已經得到廣泛應用。

1．3ABISOLID測序平臺美國應用生物系統公司（AppliedBiosystems，ABI）的3730系列全自動測序儀在第一代測序方面一直占據著重要地位。新一代測序技術出現以后，ABI公司推出SOLiD新一代測序平臺，并且不斷進行改進，如今升級到SOLiD5500xlSystem。與Roche／454測序儀相似，ABISOLID測序平臺也是通過微乳滴PCR擴增DNA模板，該平臺的獨特之處在于堿基測序過程中沒有采用傳統的聚合酶延伸反應，而是以四色熒光標記寡核苷酸的連續連接反應為基礎［5］。SOLiD測序過程中的連接反應沒有DNA聚合酶合成過程中常有的錯配問題，再加上SOLiD特有的“雙堿基編碼技術”又提供一個糾錯機制，這種設計上對每個堿基判讀2次的優勢使得SOLiD在系統準確性上大大領先于其他新一代測序平臺，SOLiD5500系統準確性達到99．99％。該測序平臺的主要缺點是序列讀長相對較短，目前SOLiD5500系統最大測序讀長為75bp，末端配對讀長為75bp×35bp。

1．4其他新一代測序平臺HelicosBiosciences公司開發的HeliScopeSingleMoleculeSequencer，原理是“單分子測序”，仍然基于邊合成邊測序；但是不同于以上3種測序平臺，不需要經過PCR擴增構建單鏈DNA測序文庫，它采用了一種非常靈敏的熒光捕獲系統，能夠直接檢測到一個單分子所釋放的熒光信號［6］。目前，HeliScopeSingleMoleculeSequencer的序列讀長范圍是25bp到55bp，平均讀長是35bp。Heli－ScopeSingleMoleculeSequencer避免了PCR擴增而引入的不確定因素，同時所消耗的試劑量大大降低，有利于控制成本；但是該平臺測序準確度明顯較低，主要是缺失錯誤。而經過改造后，在第一輪測序結束，通過加熱解鏈去掉延伸鏈，可以對同一模板從相反的方向進行二輪測序，這樣顯著提高了準確率。另一種單分子測序平臺是PacificBiosciences公司開發的單分子實時技術（Singlemoleculerealtime，SMRT），其單分子的熒光探測依賴于一種被稱為零級波導（Zeromodewaveguide，ZMW）的納米結構來實時觀察DNA聚合和消除背景熒光干擾［7］。單分子實時技術與HeliScopeSingleMole－culeSequencer平臺一樣，提高原始數據的準確率是一個挑戰，不過同樣可以通過對同一樣品進行重置后的多輪測序來降低錯誤率，而且該平臺在長序列產出、高速測序和低成本等方面具有巨大優勢。

2新一代測序技術的主要應用

隨著新一代測序技術商業化平臺的不斷推出，由于其在基因組學研究方面具有低廉的價格、高通量的數據、簡易的樣品處理過程等優點，生物科學家已開始越來越多地應用新一代測序技術來解決相關生物學問題。

2．1全基因組從頭測序（denovosequencing）對于基因組序列未知的物種，可以應用新一代測序系統對其基因組進行從頭測序，通過拼接組裝，從而獲得該物種的基因組序列圖譜。Huang等［8］通過聯合運用Sanger測序技術和Illumina／SolexaGenomeAnalyzer測序平臺繪制了黃瓜基因組草圖，得到平均72．2倍覆蓋度的基因組序列，其中3．9倍是用Sanger技術得到的，68．3倍是用Illumina／SolexaGenomeAnalyzer測序平臺得到的。Wang等［9］利用Illumina／SolexaGenomeAn－alyzerⅡ測序儀對白菜基因組進行測序，產生72倍覆蓋度的成對短序列，組裝得到283．8Mb基因組序列，覆蓋基因序列98％以上，預測基因大約42000個，發現白菜基因組中存在3個類似但基因密度明顯不同的亞基因組，推測白菜基因組在進化過程中經歷了2次全基因組復制事件與2次基因丟失過程，還發現在基因組發生復制之后，與器官形態變異有關的生長素相關基因發生了顯著的擴增，這可能是白菜類蔬菜具有豐富根莖葉形態變異的根本原因。相對于傳統的Sanger測序技術，采用新一代測序技術實現全基因組的從頭測序，從根本上改變著解析生物基因組的方式，其強大的數據產出能力，顯著提高了基因組測序效率，急劇降低了成本，使得對任意物種進行全基因組測序成為現實。目前，一大批重要作物的全基因組正在應用新一代測序技術進行測序，包括基因組復雜的油菜和棉花等。

2．2全基因組重測序（Resequencing）在某物種參考基因組序列已知的前提下，新一代測序平臺能高效率地完成該物種不同群體或個體的全基因組測序，從而進行基因組序列的差異化分析。由于新一代測序技術的高通量、大規模、低成本，所以物種基因組重測序迅速得到推廣，應用前景廣闊。Lai等［10］對6個玉米骨干自交系進行了全基因組重測序，每個自交系平均測序深度約5．4倍，分析發現100多萬個單核苷酸多態性位點和3萬多個插入缺少多態性位點，以及101個低多態性序列區段，這些區段內含有大量在選擇過程中與玉米自交系優良性狀有關的候選基因，同時還鑒定出數百個基因在自交系之間有存在與丟失的多態變化，這種基因存在與丟失多態性和其他有害突變的互補作用可能與雜種優勢有關。Huang等［11］通過對517個水稻地方品種的全基因組測序鑒定出約360萬個單核苷酸多態性位點，并構建了高密度的水稻單體型圖譜（HapMap），然后利用373個秈稻品種群體對株型、產量、子粒品質、著色和生理特征等14個農藝性狀進行全基因組關聯分析，結果鑒定的位點可解釋約36％的表型變異，其中有6個位點的峰值信號與之前鑒定的農藝性狀基因緊密連鎖，該研究為水稻遺傳學研究和育種提供了重要的基礎數據資源。Xu等［12］利用40個水稻栽培品系和10個野生稻材料進行15倍覆蓋度以上的全基因組重測序，獲得約650萬個單核苷酸多態性位點，80多萬個插入缺失突變和9萬多個結構變異以及1676個拷貝數變異，基于這些數據分析發現數千個在水稻馴化過程中與人工選擇有關的基因，這些基因可能與水稻相關農藝性狀有重要的相關性。應用新一代測序平臺，通過對不同目的材料的全基因組重測序可以實現單核苷酸多態性位點進行基因分型的檢測［11，13］、不同群體間進化分析和表型變異相關基因的發掘［12，14－15］、突變基因位點的快速定位［16］等。

2．3RNA測序把高通量測序技術應用到由mRNA反轉錄生成的cDNA測序上，從而獲得特定樣品中基因mR－NA片段的信息，這就是RNA測序。根據采用的測序策略不同，RNA測序分為表達標簽測序（Tag－Seq）［17］和轉錄組測序（RNA－Seq）［18］。表達標簽測序（Tag－Seq）策略的原理是一個轉錄本3＇端特定位置21bp（CATG＋17bp）的標簽可以特異性地代表該基因。首先采用2種特殊的限制性核酸內切酶NlaIII和MmeI制備標簽文庫（Taglibrary），然后利用深度測序技術獲得所有標簽的序列信息，最后將這些標簽與參考基因序列數據庫比對，得到樣品中基因的表達情況。每個基因的表達量來源于其對應的標簽數量，相對于傳統的基于核酸雜交的基因芯片技術，標簽測序技術不需要預先針對已知基因序列設計探針，結果能夠提供更為準確的數字化信號，而且檢測通量更高、范圍更廣［19］。Wang等［20］應用標簽測序技術研究了徐州142和其無絨突變體在棉花纖維發育起始階段和纖維伸長階段胚珠的基因表達譜，基因差異表達分析發現在野生型和突變體對應時期的比較中表達基因的種類和數量都明顯不同，而且重點分析了表達差異倍數最大的前20個基因，涉及纖維素合成、磷脂酶及脫氫酶等。Wang等［20］還分析了已經功能驗證的與纖維發育有關的基因，結果發現這些基因理論表達模式與表達譜分析結果一致，充分證明標簽測序技術的準確性，與前人利用基因芯片技術的結果相比較，標簽測序獲得數字基因表達譜數據在分析深度和范圍上都明顯改善。轉錄組測序（RNA－Seq）是通過新一代高通量測序技術對片段化mRNA反轉錄生成的cDNA進行測序，利用拼接并統計相關序列測序次數，獲得不同轉錄本（mRNA）的表達信息。轉錄組測序是目前深入研究全轉錄組復雜性的強大工具，可以研究任意物種的特定狀態下所有基因轉錄本的豐度信息，以及發現新的轉錄本、可變剪接體和檢測單核苷酸多態性等。Zhang等［21］第一次應用轉錄組測序技術對栽培水稻的8個不同組織進行了轉錄組學水平分析，發現了一大批以前技術未發現的新轉錄本，可變剪接分析表明33％的水稻基因存在順式剪接，另外鑒定出由于反式剪接產生的234個轉錄本，這些結果證明水稻轉錄調控比以前預測要復雜得多。這一結論在另一模式植物擬南芥中也被證實，Filichkin等［22］通過相同的方法，發現至少42％的含有內含子的基因在擬南芥中有可變剪接，這一數據遠遠高于以前基于cDNA／EST測序方法的估計值。Graham等［23］利用Roche454測序平臺對青蒿材料進行轉錄組測序，鑒定關鍵基因和分子標記，然后構建了一張青蒿遺傳圖譜，定位了與青蒿素產量有關的數量性狀基因位點（QTL）。

2．4其他應用基于新一代測序技術的小分子RNA測序（SmallRNAsequencing），通過分離特定大小的RNA分子進行高通量測序，能夠一次性獲得數百萬條小分子RNA序列，可以快速定性和定量地鑒定某種組織或細胞群在特定狀態下的幾乎所有小分子RNA。應用小分子RNA測序方法能分析不同樣品中的小分子RNA差異表達，鑒定新的小分子RNA并預測其靶基因。Wang等［24］利用陸地棉品種徐州142及其無纖維無短絨突變體的胚珠作為材料，發現7個纖維起始相關的miRNA，并明確了其作用的靶基因，另外還鑒定出36個新的棉花miRNA。小分子RNA測序還可以與轉錄組測序技術相結合，綜合分析mRNA和小RNA的表達模式，研究小RNA與其靶基因表達的相關性［25］。高通量測序技術與染色體免疫共沉淀技術（Chromatinimmunoprecipitation，ChIP）結合，即ChIPSequencing，通過采用特異性抗體免疫沉淀目的蛋白質，富集目的蛋白質所結合的基因組DNA片段并在高通量測序平臺上測序，從而檢測到目的蛋白在基因組中的結合位點，全面分析蛋白質與DNA的相互作用。Kaufmann等［26］成功將該技術應用在對擬南芥轉錄因子SEPALLATA3在基因組中結合位點的研究。DNA甲基化是非常重要的表觀遺傳修飾方式，基于新一代測序技術的亞硫酸氫鹽（Bisulfite）處理測序技術是分析全基因組DNA甲基化的有效手段，Lister等［27］就通過該技術獲得了擬南芥野生型與DNA甲基轉移酶突變體的全基因組甲基化圖譜。

3新一代測序技術對作物分子育種的影響

新一代測序技術的出現，催生了一批新的基因組學和“后基因組學”研究手段，使遺傳學研究產生了革命性進步，呈現出全新的面貌。基于新一代測序技術的基因組水平上的全基因組測序、重測序方法和轉錄水平上的表達譜分析、轉錄組測序以及研究轉錄后調控的小RNA測序等分析方法使科研工作者對作物生長發育過程各種生理生化機制的探索上升到基因組水平，從而對作物分子生物學和品種遺傳改良帶來深遠影響。更多的基因組未測序物種應用新一代測序平臺高效率、低成本地完成全基因的從頭測序，豐富核酸序列和基因資源，為進一步開發分子標記、挖掘重要功能基因和解析生長發育機制等分子生物學研究提供重要基礎和依據。通過全基因組重測序，可以完成檢測單核苷酸多態性位點進行基因的分型、不同群體間進化分析和表型變異相關基因的發掘、快速定位突變基因位點等。基于新一代測序技術的大規模轉錄組學分析方法，相對于基因芯片技術，以其高通量和定量信息更準確的優點，被迅速地廣泛應用，大量實驗證明這些方法是分離候選目的基因和研究目標性狀形成或特定生理發育過程分子機制的有效途徑。總的來說，分子標記的開發、遺傳圖譜的構建、功能基因的分離以及遺傳機制的闡明等，極大地豐富分子標記輔助選擇育種、轉基因育種和分子設計育種的利用資源，顯著促進種質資源的挖掘與利用效率，大大縮短育種年限和降低成本投入。目前已有報道，通過對玉米骨干自交系進行全基因組重測序探究雜種優勢機理［10］，在水稻育種方面，新一代測序技術已廣泛應用于發掘與重要農藝性狀有關基因［11－12］。可以預見，隨著技術方法的不斷創新，新一代測序技術必將促進作物分子育種的快速發展，使利用功能基因組學進行分子設計育種逐步成為現實。