棉花幼根水淹的影響分析范文

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一般認(rèn)為，在水淹狀態(tài)下，植物缺氧，呼吸受阻，乙醇發(fā)酵的無氧呼吸作用增強(qiáng)，對(duì)植物正常生長(zhǎng)發(fā)育影響較大甚至導(dǎo)致植物死亡。但植物對(duì)逆境的響應(yīng)表現(xiàn)出積極主動(dòng)的應(yīng)激過程，通過相關(guān)基因／蛋白的表達(dá)變化，在一定程度上來提高個(gè)體的抗逆性。研究表明，乙醇脫氫酶（Alcoholdehydro－genase，ADHa）［1－2］和醛脫氫酶（Betaine－aldehydede－h(huán)ydrogenase，BADH）［3］與植物的抗逆性相關(guān)。在棉花發(fā)育的初期階段，水淹是否對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響，其抗逆性的機(jī)制，特別是與ADHa和BADH相關(guān)的機(jī)制研究還未見報(bào)道。本文研究了神農(nóng)3號(hào)棉花在水淹環(huán)境下，ADHa和BADH基因相對(duì)表達(dá)量的變化，為棉花的抗?jié)硻C(jī)理研究提供數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)材料神農(nóng)3號(hào)棉花種子由江蘇省沿江地區(qū)農(nóng)科所提供，2011年7月種植于花盆土壤中，室溫下待幼苗生長(zhǎng)至1cm時(shí)，隨機(jī)分為對(duì)照組和水淹脅迫組，對(duì)照組仍在室溫下常規(guī)種植培養(yǎng)，水淹組則淹沒于水中；各組分別在0h、12h、1d、2d、4d和8d時(shí)取根尖處1cm組織待用。

1．2主要試劑與儀器RNAisoPlus總RNA提取試劑盒、SYBR•PrimeScript•RT－PCRKit購自TaKaRa公司，引物由上海英駿公司合成；ABI7500Realtime－PCRSystem；ABI2720型PCR儀；其它各種化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1．3方法

1．3．1總RNA提取。取約1cm長(zhǎng)根尖若干于勻漿器中，加入1mLRNAisoPlus充分研磨，至裂解液呈透明狀。轉(zhuǎn)入離心管中，室溫靜置5min，加入0．2mL氯仿，震蕩混勻后再室溫靜置5min，12000×g離心10min，吸取上清液，加入等體積異丙醇混勻，室溫靜置10min，12000×g離心10min，棄上清液，用75％乙醇洗滌沉淀，12000×g離心5min，棄乙醇，然后用適量的DEPC水溶解RNA。

1．3．2反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取各個(gè)樣品總RNA1μL進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，依次加入5×Buffer2μL、Mix0．5μL、隨機(jī)引物0．5μL、RNA1μL，DEPC水補(bǔ)足至10μL，37℃保溫15min，85℃10s終止反應(yīng)，－20℃保存。1．3．3Real－timePCR反應(yīng)。根據(jù)GenBank中登錄的目的基因ADHa（AF085064）、BADH（AY461804）和內(nèi)參actin（EF464673）序列，應(yīng)用NCBIPrimer－blast工具（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／tools／primer－blast／index．cgi•LINK＿LOC＝BlastHome）設(shè)計(jì)引物。引物資料見表1。以上述方法逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，按照SYBR•PrimeScript•RT－PCRKitII試劑盒說明操作，每管總反應(yīng)體積為25μL，其中cDNA模板2μL，上、下游引物（10pmol•L－1）各1μL，2×MIX12．5μL，水8．5μL。以actin為內(nèi)參，并設(shè)3個(gè)重復(fù)管，以0h組為參考進(jìn)行相對(duì)定量，ABI7500Softwarev2．0．4進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用Mi－

2結(jié)果

2．1水淹對(duì)ADHa表達(dá)的影響隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，ADHa表達(dá)量急劇上升，水淹12h時(shí)達(dá)到第一個(gè)高峰；水淹1d時(shí)表達(dá)下降，水淹3d后ADHa表達(dá)量不斷升高。與對(duì)照相比，脅迫組在各時(shí)間段的表達(dá)差異均達(dá)到極顯著水平；其中差異最大的時(shí)間段是12h，差異達(dá)到8．4倍（圖1）。

2．2水淹對(duì)BADH表達(dá)的影響在水淹12h和1d，脅迫組和對(duì)照組表達(dá)變化均不顯著；水淹2d和4d時(shí)2組BADH表達(dá)逐漸升高，但對(duì)照組高于脅迫組，差異分別達(dá)到顯著或極顯著；水淹8d時(shí)2組BADH表達(dá)均回落，并且無顯著差異（圖2）。

3討論

棉花為世界性的主要農(nóng)作物，低溫、干旱、鹽漬、水淹等非生物脅迫的研究已成為熱點(diǎn)。羅振等以棉花干物質(zhì)積累、葉片光合速率、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和葉綠素含量為觀察指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)鹽澇漬單獨(dú)或雙重脅迫均產(chǎn)生不同的影響［4］；李銳等［5］利用雙向電泳技術(shù)，進(jìn)行了不同抗冷級(jí)別的棉苗低溫誘導(dǎo)蛋白表達(dá)譜的差異比較，發(fā)現(xiàn)了有數(shù)十種具有顯著差異的蛋白。ADHa是廣泛存在于生物體中與醇代謝相關(guān)的酶。研究表明，乙醇發(fā)酵途徑是維持缺氧環(huán)境下各項(xiàng)正常生理功能和內(nèi)部環(huán)境所需能量的途徑之一［6］。劉登望等［1］觀察到水淹時(shí)花生根系A(chǔ)DHa活性均有大幅增加；Kato－NoguchiH等觀察到4種培育中的水稻在經(jīng)歷48h缺氧脅迫后，不僅胚芽鞘中的乙醇含量上升，ADHa和丙酮酸脫羧酶（PDC）活性也均升高［7］；VuHTT等使用RT－PCR方法觀察到水脅迫對(duì)水稻ADH（ADH1、ADH2）表達(dá)具有顯著的促進(jìn)作用［8］。本實(shí)驗(yàn)觀察到水淹可刺激棉花幼根ADHa表達(dá)迅速上升，在12h時(shí)就可達(dá)到一個(gè)峰值，比對(duì)照高出8．4倍。雖然在1d時(shí)表達(dá)下降，但相比對(duì)照而言，差值仍達(dá)到4倍。值得注意的是，隨著時(shí)間的推移，對(duì)照組ADHa的表達(dá)也在不斷升高，其機(jī)理目前還不詳。本文的結(jié)果從另一個(gè)角度證實(shí)了乙醇發(fā)酵是棉花對(duì)缺氧的適應(yīng)表現(xiàn)。植物中存在多種醛脫氫酶［9］，其中甜菜堿醛脫氫酶（BADH）是一種研究較多的醛脫氫酶之一，與多種非生物脅迫相關(guān)［10］。李永華等比較了抗旱性不同的小麥品系在不同水脅迫下，不同生長(zhǎng)期中BADH的表達(dá)水平，認(rèn)為BADH與抗性相關(guān)［11］；通過BADH轉(zhuǎn)基因方法，使得作物獲得了更強(qiáng)的抗逆性［12］，羅曉麗等［13］研究發(fā)現(xiàn)，BADH轉(zhuǎn)基因棉花株系抗鹽和抗凍性能顯著提高。朱玉慶等［14］通過轉(zhuǎn)基因方法，將甜菜堿合成中的一種酶－膽堿單氧化物酶（CMO）轉(zhuǎn)化兩種棉花品系，發(fā)現(xiàn)抗旱性均顯著提高。本研究發(fā)現(xiàn)，水淹對(duì)BADH表達(dá)無刺激作用，而且在2d和4d時(shí)，表現(xiàn)出顯著的抑制作用，提示水淹脅迫對(duì)BADH表達(dá)的影響可能與其它脅迫的機(jī)制不同，還有待進(jìn)一步探究。