真空采血管對(duì)血漿血清多肽質(zhì)譜的影響范文

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摘要：目的觀察不同添加劑處理的真空采血管留取標(biāo)本對(duì)患者血漿/血清多肽檢測(cè)的影響，確立血漿/血清多肽質(zhì)譜分析臨床適用的采血管。方法招募6名志愿者，男性2例，年齡(28±2)歲；女性4例，年齡(30±3)歲，采集志愿者的靜脈血液樣本放入6種臨床上日常使用的真空采血管，并按采血管的種類分為6組。采用弱陽(yáng)離子磁珠提取多肽，Clin-TOF平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)，通過BioExplorer軟件和SPSS22.0進(jìn)行多肽峰的比較。結(jié)果6組采血管共出峰117個(gè)，108個(gè)多肽峰具有差異(P＜0.05)，95個(gè)具有顯著差異(P＜0.01)，血漿管之間差異峰的數(shù)量顯著高于血清管之間；分離膠促凝管正態(tài)分布的血清多肽峰最多(110個(gè))，且峰強(qiáng)度大于300的強(qiáng)勢(shì)峰出峰數(shù)均值最高，標(biāo)準(zhǔn)差最小(27.7±1.97)；根據(jù)正態(tài)分布多肽峰數(shù)、強(qiáng)勢(shì)峰出峰均值、全峰強(qiáng)度、強(qiáng)勢(shì)峰強(qiáng)度這四個(gè)指標(biāo)進(jìn)行因子分析，分離膠促凝管得分最高。結(jié)論含有分離膠的促凝管是最適用基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析的最佳采血管。

關(guān)鍵詞：多肽；血漿；基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；

近年來，質(zhì)譜技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)展迅速并廣泛應(yīng)用，涉及了多個(gè)學(xué)科。目前常用的質(zhì)譜技術(shù)之一——基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)，因其高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高通量、易于自動(dòng)化等特點(diǎn)，為其在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了廣闊的前景和發(fā)展空間[1-3]。質(zhì)譜技術(shù)可用來尋找體內(nèi)特異的生物標(biāo)志物，從而對(duì)疾病的早期診斷起到獨(dú)特高效的篩選作用，達(dá)到理想的疾病早期預(yù)警目的。質(zhì)譜技術(shù)可以對(duì)多種生物樣本進(jìn)行檢測(cè)，其中血液樣本以其取材方便、樣本穩(wěn)定度高、容易保存等特點(diǎn)更廣泛的應(yīng)用于臨床。因檢測(cè)需要，血液樣本采集常使用添加了不同抗凝劑或促凝劑的真空采血管，對(duì)于不同真空采血管對(duì)生化指標(biāo)的影響已有大量報(bào)道[4-6]。隨著質(zhì)譜技術(shù)在臨床的推廣應(yīng)用，相應(yīng)的分析前實(shí)驗(yàn)條件的摸索應(yīng)同時(shí)開展。本文觀察不同真空采血管中的添加劑對(duì)質(zhì)譜分析的影響，以篩選出對(duì)質(zhì)譜分析效果最佳的真空采血管。

材料和方法

1樣本獲取

招募志愿者6名(男性2名，女性4名)，平均年齡30歲，編號(hào)A、B、C、D、E、F。采集每名志愿者6份血液樣本放入6種臨床上日常使用的真空采血管中。按采血管的種類分為6組(第1組為添加枸櫞酸鈉的抗凝采血管，編號(hào)A1、B1…F1；第2組為添加EDTA2K的抗凝采血管，編號(hào)A2、B2…F2；第3組為添加肝素鋰的抗凝采血管，編號(hào)A3、B3…F3；第4組為添加氟化鈉的抗凝采血管，編號(hào)A4、B4…F4；第5組為無添加的促凝采血管，編號(hào)A5、B5…F5；第6組為添加分離膠的促凝采血管，編號(hào)A6、B6…F6)。放置15min后，3000g離心10min后進(jìn)入質(zhì)譜分析的前處理流程。

2試劑與儀器

血漿/血清多肽提取和測(cè)定為血漿/血清低豐度多肽。主要試劑有多肽提取用的SPE-C磁珠試劑盒(Bioyong，中國(guó))，標(biāo)準(zhǔn)品Peptidecalibrationstandard和標(biāo)準(zhǔn)品ProteincalibrationstandardⅠ(Sigma，德國(guó))，基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)(Sigma，德國(guó))，100%色譜級(jí)丙酮和100%色譜級(jí)乙醇(J.K.Baker，美國(guó))。主要消耗品包括：96targetsAnchorchip靶(BrukerDalton，德國(guó))，排管(Axygen，美國(guó))，eppendorf管(Axygen，美國(guó))，槍頭(Axygen，美國(guó))，移液器(Eppendorf，德國(guó))，磁架(Bioyong，中國(guó))。檢測(cè)儀器為基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)Clin-TOF-Ⅰ(北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司，中國(guó))。

3樣品前處理與質(zhì)譜分析

血漿多肽提取流程按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程操作，血漿質(zhì)譜分析操作流程按照布魯克道爾頓公司提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行。將200μl樣品管置于孔板上，依次加入10μl磁珠，加入95μl磁珠結(jié)合緩沖液(CB)，加入10μl血漿樣本，在室溫靜置。將樣品管在磁珠分離器上靜置1min，磁珠富集到管底并貼壁，與懸浮的液體分離，吸去上清的液體。將樣本放入孔板中，加入100μl磁珠清洗緩沖液，吸去上清液體，并重復(fù)此步驟，保證上清液完全被吸走。將樣品放置于孔板上，加入10μl磁珠洗脫液(CE)反復(fù)吸打，靜置，將上清液移出到已標(biāo)記的0.2ml的樣品管中待測(cè)。Clin-TOF儀器檢測(cè)，點(diǎn)靶前對(duì)儀器進(jìn)行校正，點(diǎn)靶方式為覆蓋法，將點(diǎn)好多肽提取物的靶放入Clin-TOF儀器中，點(diǎn)擊激光Shot，累積Shot圖。質(zhì)譜采用的是線性模式，每個(gè)樣本采集50個(gè)frofile，每個(gè)frofile10個(gè)shots，荷質(zhì)比范圍M/Z1000-10000。所有樣本的累積激光Shot圖用BE軟件和SPSS22.0進(jìn)行生物信息學(xué)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，尋找鑒定差異峰。

4優(yōu)選標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)正態(tài)分布多肽峰數(shù)、強(qiáng)勢(shì)峰出峰數(shù)均值、全峰強(qiáng)度、強(qiáng)勢(shì)峰強(qiáng)度進(jìn)行因子分析和排序，得分最高者為最優(yōu)采血管。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用BioExplorer軟件(Bioyong，中國(guó))和SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，血漿/血清多肽峰的正態(tài)性檢驗(yàn)采用AdersonDarlingTest。峰強(qiáng)度和出峰數(shù)用-x±s表示，行因子分析和排序。組間差異多肽峰的比較為One-WayAnova+兩兩比較LSD檢驗(yàn)，或非參數(shù)分析KruskalWallisTest。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié)果

1血漿多肽峰的正態(tài)性/變異分析

6組樣本共出峰117個(gè)，同一人的6種真空采血管血漿多肽峰的圖譜形態(tài)不同(見圖1)。在117個(gè)多肽峰中，符合正態(tài)分布的多肽峰最多的為第6組含分離膠的促凝管(110個(gè))，其次為第3組(106個(gè))、第5組(102個(gè))、第2組(95個(gè))、第4組(90個(gè))、第1組(90個(gè))，表明第6組的真空采血管所采集的血漿多肽峰變異最小。

2差異多肽峰分析

117個(gè)多肽峰中組間差異峰有108個(gè)(P＜0.05)，其中P＜0.01的差異峰為95個(gè)。組1~組4為血漿管，組5和組6為血清管。組間兩兩比較，2組和6組之間差異峰數(shù)量最多(92個(gè))，5組和6組之間差異峰的數(shù)量最少(4個(gè))，見表1。說明在差異峰的數(shù)量上，不僅血漿管與血清管之間存在顯著差異，即使是血漿管之間也存在差異，但以血清管之間差異最小，血漿管與血清管之間差異最大。6組中峰強(qiáng)度最大的前10個(gè)多肽峰除第3組多肽峰1277.0m/z外(P=0.449)，均為差異峰(P＜0.01)(見圖2)。說明采血管的種類不同也造成了各組強(qiáng)勢(shì)峰的顯著性差異。

3強(qiáng)度＞300的強(qiáng)勢(shì)峰出峰數(shù)比較

應(yīng)用Bioex-plorer軟件采集每個(gè)樣本血漿/血清多肽峰強(qiáng)度＞300的出峰數(shù)和強(qiáng)度，比較出峰情況，考察均一性。各組出峰數(shù)均值分別為26.7±4.50(1組)，26.3±3.67(2組)，22.7±3.08(3組)，25.7±3.67(4組)，26.3±2.80(5組)，27.7±1.97(6組)，根據(jù)每位志愿者的強(qiáng)勢(shì)峰出峰情況顯示，第6組均一性最佳(見表2)。各組全峰強(qiáng)度和強(qiáng)勢(shì)峰強(qiáng)度比較，相關(guān)性較好(見圖3)。

4采血管的選擇

根據(jù)正態(tài)分布多肽峰數(shù)、強(qiáng)勢(shì)峰出峰數(shù)均值、全峰強(qiáng)度、強(qiáng)勢(shì)峰強(qiáng)度這四個(gè)指標(biāo)進(jìn)行因子分析和排序(見表3)。根據(jù)分析結(jié)果，第6組含有分離膠的促凝管得分最高，最適合MALDI-TOFMS質(zhì)譜分析。基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)是近年來發(fā)展起來的一種軟電離新型有機(jī)質(zhì)譜，近年來已成為檢測(cè)和鑒定多肽、蛋白質(zhì)、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多種合成聚合物的強(qiáng)有力工具。其原理是：當(dāng)用一定強(qiáng)度的激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離，電離的樣品在電場(chǎng)作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)。MALDI-TOF-MS的中心技術(shù)就是依樣品的質(zhì)荷比(m/z)的不同來進(jìn)行檢測(cè)，并測(cè)得樣品分子的分子量[7]。本研究中采用磁珠提取血漿/血清多肽，磁珠試劑盒以弱陽(yáng)性離子交換原理為基礎(chǔ)，采用磁珠在高鹽低pH溶液中特異性吸附生物樣本中的蛋白質(zhì)多肽，在低鹽溶液中釋放蛋白多肽分子，從而捕獲血漿/血清中的蛋白質(zhì)多肽，可直接用于基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜的分析。有研究顯示，血漿與血清中代謝物濃度有明顯差異[8-11]，基于核磁共振的代謝組學(xué)研究證明等離子體、EDTA、肝素和枸櫞酸抗凝血?jiǎng)┛梢試?yán)重影響代謝信息的復(fù)原[12-13]，本實(shí)驗(yàn)中不同添加劑的采血管在同一條件下獲得的多肽峰出峰圖譜具有顯著差異，這一試驗(yàn)結(jié)果與其他研究相一致。六組樣本共出峰117個(gè)，其中組間差異多肽峰共108個(gè)(P＜0.05)，說明采血管中的添加劑對(duì)多肽峰的檢測(cè)具有明顯的影響。原因是抗凝或促凝劑激活的凝血過程不同，蛋白在此過程中的水解片段也不同。凝血與纖溶的平衡是動(dòng)態(tài)的，這一過程是一系列的酶促反應(yīng)，蛋白酶的連續(xù)激活與失活，血小板失活導(dǎo)致凝塊形成，這些都有可能釋放出肽和蛋白質(zhì)片段[14-15]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：第六組含分離膠的促凝管樣本符合正態(tài)分布的多肽峰最多(110個(gè))，說明用第六組采血管檢測(cè)出來的樣本變異最小，出峰最穩(wěn)定。在血清中，代謝物的濃度要普遍高于血漿，但兩者仍呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性[16-17]。Breier等的研究指出，血清中101種代謝物濃度顯著高于血漿，血清中代謝物的可靠性更高[18]。我們的研究同樣發(fā)現(xiàn)：血清管的峰強(qiáng)疊加普遍高于血漿管。血清分離膠作為一種惰性半固體，多由聚酯、聚烯烴和丙烯等材料構(gòu)成，具有抗氧化、耐高溫、抗低溫，高度穩(wěn)定的特點(diǎn)，并具有很強(qiáng)的觸變性，可在血清和血細(xì)胞之間存在固化屏障，保障血清化學(xué)成分的穩(wěn)定。本研究中對(duì)峰強(qiáng)度大于300的多肽峰進(jìn)行比較，第六組出峰均值最大，標(biāo)準(zhǔn)差最小，從累積峰強(qiáng)度來看，第六組雖然略低于第四組和第五組，但明顯高于前三組的血漿管。根據(jù)正態(tài)分布多肽峰數(shù)、強(qiáng)勢(shì)峰出峰數(shù)均值、全峰強(qiáng)度、強(qiáng)勢(shì)峰強(qiáng)度這四個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)打分，第六組得分最高。綜上所述，含有分離膠的促凝管為最適用于質(zhì)譜分析的真空采血管。

參考文獻(xiàn)

1張寧，陸學(xué)東，吳正林.飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在糖尿病腎病患者尿蛋白成分分析中的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2016，31（5）：160-164.

6李慧，白利芬，惠玉芬，等.不同采血管在不同存放條件下對(duì)循環(huán)酶法同型半胱氨酸測(cè)定結(jié)果的影響［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2015，12（22）：3294-3296.

7毛遠(yuǎn)麗，秦建成，李波.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在感染性疾病病原及耐藥檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.傳染病信息，2014，27（5）：270-273.

作者：郭菲 高靜 賈興旺 董矜 楊秋亮 顏光濤 王成彬 田亞平 王涌 單位：解放軍總醫(yī)院