泡菜中乳酸菌的抗菌性范文

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《中國(guó)調(diào)味品雜志》2014年第七期

1實(shí)驗(yàn)方法

1．1乳酸菌的分離純化用無(wú)菌生理鹽水稀釋樣品（泡菜水＋部分菜葉）液于一定濃度，取以上稀釋液1mL于滅菌的MRS（加入了2％CaCO3）培養(yǎng)基中混勻，38℃培養(yǎng)48h。挑取平板底部和表面的、圓形或梭形的、有溶鈣圈的乳酸菌疑似單菌落，在MRS平板中劃線接種，38℃培養(yǎng)48h，平板純化4代，確認(rèn)為純培養(yǎng)物后，對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢觀察細(xì)胞形態(tài)、乳酸定性實(shí)驗(yàn)［4］等，轉(zhuǎn)斜面，4℃保存。

1．2抗菌活性乳酸菌的篩選以大腸桿菌為指示菌，用牛津杯法測(cè)定以上各個(gè)乳酸菌代謝物的抑菌活性，測(cè)量抑菌圈大小，挑選出抑菌圈較大、較明顯的菌株。

1．3指示菌菌懸液制備將實(shí)驗(yàn)室保存的3種指示菌活化后，分別接種于滅菌的普通肉湯液體培養(yǎng)基中，于38℃培養(yǎng)24h；將以上指示菌分別配制成（100～10－7）不同梯度的菌懸液，然后分別涂平板計(jì)數(shù)，測(cè)定其生長(zhǎng)量。分離鑒定的產(chǎn)璞酵母接種于滅菌的YPD液體培養(yǎng)基中，于29℃培養(yǎng)24h。

1．4乳酸菌代謝產(chǎn)物的制備將分離鑒定的乳酸菌分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于38℃培養(yǎng)48h，離心（4500r／min，15min），取上清液，在無(wú)菌工作臺(tái)，經(jīng)細(xì)菌過(guò)濾器（0．22μm濾膜）過(guò)濾，收集濾液即為乳酸菌的代謝產(chǎn)物，用pH計(jì)測(cè)定其pH值，用電位滴定法測(cè)定其總酸度［5］（以乳酸計(jì)），然后取出10mL中和pH至7．0，將代謝物原液和中性代謝物放入4℃冰箱備用。

1．5乳酸菌菌體制備將1．2．4分離得到的菌泥，用0．85％的無(wú)菌鹽水洗滌，再離心（4500r／min，15min），如此重復(fù)3次，將最后一次得到的菌泥用0．85％的無(wú)菌鹽水振蕩搖勻，并調(diào)節(jié)生長(zhǎng)量為107cfu／mL，4℃冰箱備用。

1．6指示菌最適生長(zhǎng)量的測(cè)定抗菌活性測(cè)定［6］，用牛津打孔平板法，將融化的無(wú)菌水瓊脂倒入大小一致的無(wú)菌平皿中，每個(gè)平皿15mL，待凝固后，用滅菌的鑷子在每個(gè)平板的水瓊脂上均勻放3個(gè)無(wú)菌牛津杯，分別取生長(zhǎng)量約為9×103，9×104，9×105，9×106，9×107，9×108，9×109cfu／mL的指示菌原菌液1mL，加入30mL融化的普通肉湯培養(yǎng)基中，充分搖勻，倒入平皿中（不能倒在牛津杯孔里），待凝固后用鑷子取出牛津杯，并在杯孔里分別加入0．2mL的各個(gè)乳酸菌代謝產(chǎn)物，于4℃冰箱放置6h［7］，以使代謝物充分?jǐn)U散，然后于38℃培養(yǎng)24h，用卡尺量取抑菌圈直徑，取平均值。

1．7乳酸菌代謝產(chǎn)物抑菌性測(cè)定方法同1．2．6。采用牛津打孔法，分別取生長(zhǎng)量約為9×106cfu／mL的各指示菌原菌液進(jìn)行測(cè)定。

1．8乳酸菌菌體的抗菌性測(cè)定將1．2．7中的0．2mL乳酸菌代謝產(chǎn)物換成0．2mL生長(zhǎng)量為107cfu／mL的各乳酸菌菌體原液，其余步驟不變。

1．9乳酸菌中性代謝產(chǎn)物的抗菌性測(cè)定方法同1．2．7。將0．2mL乳酸菌代謝產(chǎn)物換成0．2mL中和后的代謝產(chǎn)物。

2結(jié)果與分析

2．1pH值及總酸度測(cè)定由表1可知，四川泡菜中的具有良好抗菌活性的10株乳酸菌代謝物的總酸度為6．02～15．67，pH值為3．59～4．87，說(shuō)明在泡菜發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌均產(chǎn)生酸類物質(zhì)，且酸性較強(qiáng)。

2．2乳酸菌對(duì)不同生長(zhǎng)量指示菌的抑菌效果指示菌為大腸桿菌。由表2可知，除乳酸菌L8，L9，L10外，其他絕大多數(shù)的乳酸菌在指示菌生長(zhǎng)量為9×106cfu／mL時(shí)的抑菌圈最大、最明顯。所以，取指示菌的生長(zhǎng)量為9×106cfu／mL時(shí)的原菌液作為測(cè)定乳酸菌抑菌活性的指示菌液。

2．3乳酸菌代謝產(chǎn)物抑菌活性與其酸度之間的關(guān)系由表3可知，除L7外，其他乳酸菌隨著總酸度的升高，其代謝產(chǎn)物的抗菌性逐漸增強(qiáng)，證明其代謝產(chǎn)物中的抗細(xì)菌物質(zhì)主要是酸類物質(zhì)；且同一乳酸菌對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）的抗菌性更強(qiáng)，對(duì)革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）的抗菌性較弱；而對(duì)產(chǎn)璞酵母幾乎無(wú)抗菌性；L7對(duì)產(chǎn)璞酵母有一定抑制作用。從以上結(jié)果可以看出，L7代謝產(chǎn)物中除了酸類物質(zhì)還有其他的抗菌物質(zhì)，可能是酶或者過(guò)氧化物等。

2．4乳酸菌抑菌活性與代謝物及菌體的關(guān)系由表4可知，當(dāng)乳酸菌代謝物被中和至pH7．0后，除L3、L7、L10以外，其他乳酸菌都不具抗菌性；L7對(duì)細(xì)菌的抑菌圈半徑也明顯減小，而對(duì)產(chǎn)璞酵母的抑菌圈半徑無(wú)明顯變化。由此可得，在乳酸菌L7的代謝物中，除了酸，還有其他抗菌物質(zhì)存在；L3和L10的代謝物中也可能含有微量的非酸類抗菌物質(zhì)。除L3菌體有微弱抗菌性以外，其余乳酸菌菌體都無(wú)抗菌作用，證明乳酸菌的抗菌性基本上來(lái)源于其代謝產(chǎn)物。

3討論

由于人體腸道中常見致病菌為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌，且也是泡菜中經(jīng)常易染的雜菌，故本實(shí)驗(yàn)以它們?yōu)橹甘揪磺遗莶酥薪?jīng)常出現(xiàn)產(chǎn)璞酵母的生長(zhǎng)繁殖，造成生花現(xiàn)象，所以研究乳酸菌對(duì)其的抑制作用，有望改善泡菜的品質(zhì)。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選得到1株對(duì)指示菌具有優(yōu)良抗菌性的乳酸菌L7，經(jīng)鑒定為植物乳桿菌［8］。除L7對(duì)產(chǎn)璞酵母菌有一定抗菌性以外，其余均無(wú)抗菌性。這主要是由于本次所得乳酸菌的抗菌性主要由其代謝物中的酸類物質(zhì)起作用，而酵母菌可以在pH3．0～7．5范圍內(nèi)生長(zhǎng)，所以產(chǎn)璞酵母的耐酸性較好，如果其代謝物中含有除酸類物質(zhì)以外的其他抗菌物質(zhì)，例如酶類、過(guò)氧化物、細(xì)菌素［9］等，則可顯示對(duì)酵母較強(qiáng)的抑制作用。因此可以確定在L7的代謝物中存在酶類、過(guò)氧化物、細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)，或者其可以產(chǎn)生大量的新型生物防腐劑———苯乳酸。由于L3和L10的代謝物被中和以后還具有微弱抗菌能力，所以在L3和L7的代謝物中也存在除酸以外的其它抗菌物質(zhì)。本次篩選得到的10株乳酸菌其代謝產(chǎn)物的抑菌效果與其酸度呈正相關(guān)性，酸度越大，其抑菌效果越明顯，即乳酸菌代謝物的抗菌性在酸性環(huán)境中發(fā)揮得更好。L7對(duì)致病菌和產(chǎn)璞酵母均有一定抑制作用，對(duì)提高泡菜品質(zhì)起重要作用。乳酸菌菌體本身基本不具有抗菌性，而其抗菌性主要是由其代謝產(chǎn)物作用的，在發(fā)酵食品中怎樣合理利用乳酸菌代謝物的抗菌性有待進(jìn)一步研究。

作者：楊婧尹禮國(guó)馬偉玲張文學(xué)單位：四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院宜賓學(xué)院四川大學(xué)錦江學(xué)院白酒學(xué)院