陸川豬FTO基因的克隆及生物信息學(xué)探討范文

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摘要：為了獲得廣西陸川豬肥胖相關(guān)基因(fto)編碼區(qū)序列(CDS)，試驗(yàn)利用基因克隆技術(shù)，從陸川豬背最長(zhǎng)肌組織中提取總RNA，擴(kuò)增出FTO基因CDS，并運(yùn)用Lasergene7.0、ExpasyProtaram、ExpasyProtscale、NPS@在線蛋白分析系統(tǒng)和SWISS-MODEL在線分析預(yù)測(cè)系統(tǒng)等分析軟件對(duì)擴(kuò)增出的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：通過克隆測(cè)序得到的陸川豬FTO基因CDS全長(zhǎng)為1518bp，與GenBank中公布的烏金豬FTO基因CDS的同源性為99.9%，與蘇鐘豬FTO基因CDS的同源性為99.6%；陸川豬存在第1050位點(diǎn)的C→G，堿基G為陸川豬所特有，導(dǎo)致天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼幔煌ㄟ^建立系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，陸川豬與烏金豬的遺傳距離最近，它們聚為同一支；陸川豬FTO氨基酸組成中亮氨酸含量最高，占氨基酸總數(shù)的11.7%，F(xiàn)TO蛋白具有較強(qiáng)的親水性；陸川豬FTO蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含α螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈。說(shuō)明陸川豬FTO基因具有高度的保守性，今后在陸川豬脂肪沉積的研究中，F(xiàn)TO基因可作為主要候選基因之一。

關(guān)鍵詞：陸川豬；FTO；基因；克隆；軟件；生物信息學(xué)分析

肥胖相關(guān)基因（fatmassandobesityassociatedgene,FTO）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與一般人群肥胖有關(guān)系的可靠候選基因，近年來(lái)因其可調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞沉積，進(jìn)而調(diào)控肥胖發(fā)生而廣受人們的關(guān)注[1]。JFischer等[2]研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠的FTO基因后，突變后的小鼠不再肥胖，而缺失FTO基因會(huì)導(dǎo)致剛出生的小鼠發(fā)育比較緩慢、脂肪組織和去脂體重顯著減少，從而減少肥胖的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO基因在調(diào)節(jié)能量平衡、新陳代謝、食欲、去甲基化等方面具有非常重要的作用[3-5]。目前，人、山羊、牛等物種的FTO基因序列已在GenBank上公布。關(guān)于FTO基因在豬上的研究也有一些報(bào)道，如Z.Q.Du等[6]研究發(fā)現(xiàn)，豬的FTO基因定位在6號(hào)染色體上；如黃英等[7]以烏金豬的脂肪組織作為模板，成功克隆得到FTO基因序列；付言峰等[8]成功克隆得到蘇鐘豬的FTO基因。然而到目前為止還未見關(guān)于廣西地方優(yōu)良品種陸川豬FTO基因編碼區(qū)序列（CDS）的克隆及生物信息學(xué)分析的報(bào)道。本試驗(yàn)采用基因克隆技術(shù)，從陸川豬背最長(zhǎng)肌組織中克隆FTO基因，并運(yùn)用生物軟件對(duì)該基因的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在為弄清陸川豬FTO基因表達(dá)與脂肪沉積的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。

1材料

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

陸川豬,由廣西畜牧所提供，屠宰后采集陸川豬的背最長(zhǎng)肌組織，裝入滅菌消毒的凍存管中,立即置液氮中冷凍，迅速轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存，備用。

1.2主要試劑

RNAisoPlus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，均由TaKaRa公司生產(chǎn)；膠回收試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司生產(chǎn)；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，南京諾唯贊生物科技有限公司生產(chǎn)；DL-2000Marker，廣州東盛生物科技有限公司生產(chǎn)；2×TaqMasterMis，康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn)。

2方法

2.1陸川豬背最長(zhǎng)肌組織總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

剪取約100mg組織樣品置預(yù)冷過的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀后轉(zhuǎn)入1.5mLEP管中，加入RNAisoPlus1mL，之后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書提取RNA，以總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系（總體積為20μL）：OligodTPrimer1μL，10mmol/LdNTPMixture1μL，模板RNA2μL，5×PrimeScriptⅡBuffer4μL，RNase抑制劑0.5μL，PrimeScriptⅡRtase1μL，無(wú)RNA酶水10.5μL。反轉(zhuǎn)錄程序：42℃30s；95℃5s；5℃5s。

2.2引物的設(shè)計(jì)

參照參考文獻(xiàn)[錯(cuò)誤!未定義書簽。]設(shè)計(jì)FTO基因引物序列，并由深圳華大基因科技有限公司合成。引物序列：FTO-F5′-ATGAAGCGAACCCCAACC-3′和FTO-R5′-CTAGGGTTTGGCTTCCAG-3′，預(yù)計(jì)FTO基因的擴(kuò)增片段大小為1518bp。

2.3FTOcDNA的克隆

反應(yīng)體系（總體積為15μL）：2×TaqMasterMix7.5μL，上、下游引物各0.5μL，cDNA1μL，無(wú)RNA酶水5.5μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸5min。取PCR產(chǎn)物6μL，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，EB染色后c用紫外凝膠成像儀觀察并拍照。按照膠回收試劑盒說(shuō)明書回收純化FTO基因目的片段，將目的片段與pMD18-T克隆載體連接過夜；次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用菌液涂布LB平板，次日挑選陽(yáng)性克隆至含氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中。取含有目的片段的重組菌液，送至深圳華大基因科技有限公司測(cè)序。

2.4陸川豬FTO基因與同物種間的序列比對(duì)

利用Lasergene7.0生物分析軟件對(duì)陸川豬FTO基因CDS與同物種間FTO基因CDS進(jìn)行同源性及氨基酸突變分析。

2.5陸川豬FTO基因同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建利用

Lasergene7.0生物分析軟件中MegAlign程序?qū)y(cè)序得到的陸川豬FTO與其他物種FTO基因CDS進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2.6陸川豬FTO氨基酸組成分析

利用NCBI在線預(yù)測(cè)軟件ORFFinder將測(cè)序得到的FTO核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，然后利用ExpasyProtaram在線分析系統(tǒng)對(duì)陸川豬FTO的氨基酸序列進(jìn)行分析。

2.7陸川豬FTO親疏水性分析

利用ExpasyProtscale在線分析系統(tǒng)對(duì)陸川豬FTO的親疏水性進(jìn)行分析。2.8陸川豬FTO基因二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分別利用NPS@在線蛋白分析系統(tǒng)和SWISS-MODEL在線分析預(yù)測(cè)系統(tǒng)預(yù)測(cè)和分析陸川豬FTO蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)。

3結(jié)果與分析

3.1陸川豬FTO基因CDS的PCR擴(kuò)增

采用RT-PCR方法成功克隆得到陸川豬FTO基因，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果條帶位置與預(yù)期序列長(zhǎng)度1518bp一致，見圖1，因此可以初步確定此條帶為陸川豬FTO基因CDS。經(jīng)深圳華大基因科技有限公司測(cè)序發(fā)現(xiàn)，獲得了陸川豬FTO基因CDS，其長(zhǎng)度為1518bp。

3.2陸川豬FTO基因與同物種間的序列比對(duì)

通過克隆得到的陸川豬FTO基因CDS與GenBank中公布的豬FTO基因(NM_001112692)CDS的同源性為99.5%；用陸川豬FTO基因CDS與NCBI中發(fā)表的烏金豬(JQ031263)和蘇鐘豬(JX873956)這兩種豬的FTO基因CDS進(jìn)行對(duì)比，同源性分別為99.9%和99.6%，證實(shí)所克隆的片段為陸川豬FTO基因CDS序列。陸川豬FTO基因CDS與其他豬相比，存在第1050位點(diǎn)的C→G，堿基G為陸川豬所特有，導(dǎo)致天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼帷４送猓cGenBank中公布的豬FTO基因(NM_001112692)相比，陸川豬FTO基因CDS第38位點(diǎn)的G→A，導(dǎo)致甘氨酸突變?yōu)楣劝彼幔?09位點(diǎn)的C→T，導(dǎo)致丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸，第614位點(diǎn)的G→A，導(dǎo)致絲氨酸突變?yōu)樘於０罚?96位點(diǎn)的A→G，導(dǎo)致天冬酰胺突變?yōu)樘於彼幔?88位點(diǎn)的G→A，導(dǎo)致丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸；第213位點(diǎn)的A→G，第594位點(diǎn)的C→G，但均為同義突變。與GenBank中公布的蘇鐘豬(JX873956)相比，陸川豬FTO基因CDS第614位點(diǎn)的G→A，導(dǎo)致絲氨酸突變?yōu)樘於０罚?330位點(diǎn)的G→A，導(dǎo)致丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸；第213位點(diǎn)的A→G，第594位點(diǎn)C→G，但均為同義突變。與GenBank中公布的烏金豬(JQ031263)相比，陸川豬FTO基因CDS第163位點(diǎn)的T→G，導(dǎo)致半胱氨酸突變?yōu)楦拾彼帷?/p>

3.3陸川豬FTO基因同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用Lasergene7.0生物分析軟件中的MegAlign程序?qū)y(cè)序得到的陸川豬FTO基因編碼區(qū)序列與NCBI中的烏金豬(JQ031263)、牛(BC140478)、人(NM_001080432)、綿羊(EU072419.1)、蘇門答臘猩猩(NM_001132778)、山羊(NM_001319276)的FTO基因編碼區(qū)序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果同源性分別為99.9%、87.9%、87.3%、87%、86.8%和86.7%。

3.4陸川豬FTO氨基酸組成分析

利用ExpasyProtaram在線分析系統(tǒng)分析陸川豬FTO的氨基酸序列，推測(cè)出陸川豬FTO蛋白分子質(zhì)量為58132.05u，等電點(diǎn)為5.19。

3.5陸川豬FTO蛋白的親疏水性分析

借助ExpasyProtscale在線分析系統(tǒng)預(yù)測(cè)FTO的親疏水性，其中正數(shù)表示疏水，數(shù)值越大表示疏水性越強(qiáng)；而負(fù)數(shù)表示親水，數(shù)值越小表示親水性越強(qiáng)。

4討論與結(jié)論

近年來(lái)，F(xiàn)TO基因可通過調(diào)控機(jī)體攝食和脂肪代謝影響肥胖而廣受學(xué)者的關(guān)注[9]。在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與肉質(zhì)調(diào)控領(lǐng)域中，F(xiàn)TO基因在影響動(dòng)物肉品質(zhì)的關(guān)鍵因素——脂肪沉積和代謝方面的研究也取得了一定進(jìn)展。林亞秋等[10]克隆出簡(jiǎn)州大耳羊FTO基因，并發(fā)現(xiàn)24月齡山羊股二頭肌和背最長(zhǎng)肌FTO基因表達(dá)量要比8~10月齡、1~3月齡高，背最長(zhǎng)肌FTO基因表達(dá)量與其肌內(nèi)脂肪（IMF）含量呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)（r）等于-0.415。李倩等[11]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO基因在成都麻羊臂三頭肌中的表達(dá)量與IMF含量的相關(guān)系數(shù)是-0.821，呈高度負(fù)相關(guān)，說(shuō)明在山羊肌內(nèi)脂肪沉積中FTO基因很可能發(fā)揮了重要調(diào)控作用。林森等[12]克隆出藏雞FTO基因CDS，并發(fā)現(xiàn)藏雞不同發(fā)育階段不同肌肉組織中FTO基因表達(dá)水平與其IMF含量呈不同程度的相關(guān)。付言峰等[8]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO基因在蘇鐘豬不同組織中的表達(dá)量不同，從低到高的排序?yàn)楸匙铋L(zhǎng)肌＜肝臟＜肺臟＜心臟＜背膘，這與M.B.Madsen等[13]以哥廷根小型豬作為試驗(yàn)動(dòng)物的研究結(jié)果一致。陳友貴等[14]研究發(fā)現(xiàn)，10月齡貴州白冼豬不同組織中FTO基因由小到大的順序是胃<肝臟<大腸<肌肉<肺臟<小腸<心臟<腎臟<脾臟。朱琳娜[15]研究發(fā)現(xiàn)，180日齡脂肪型豬種金華豬的肌肉和脂肪組織中FTO基因表達(dá)量要比同日齡瘦肉型長(zhǎng)白豬和中間型長(zhǎng)金豬高，此研究結(jié)果說(shuō)明此基因與肥胖和機(jī)體能量代謝間的相關(guān)性較高。黃英等[7]研究發(fā)現(xiàn)，云南烏金豬脂肪和肌肉中均有FTO基因的表達(dá)，但肌肉中的表達(dá)量比脂肪低。本試驗(yàn)克隆得到陸川豬FTO基因CDS，長(zhǎng)度為1518bp，與GenBank中公布的中國(guó)云南地方脂肪型豬種烏金豬FTO基因CDS的同源性為99.9%，與江蘇自主培養(yǎng)雜交瘦肉型蘇鐘豬FTO基因CDS的同源性為99.6%。此外，陸川豬FTO基因CDS與其他豬相比，存在第1050位點(diǎn)的C→G，堿基G為陸川豬所特有，導(dǎo)致天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼帷Ｑ芯堪l(fā)現(xiàn)，豬FTO基因定位在調(diào)控眾多脂肪性狀的數(shù)量性狀位點(diǎn)的6號(hào)染色體區(qū)域上[6，16]。故FTO基因的表達(dá)很可能與陸川豬的脂肪沉積和代謝存在密切關(guān)系，從而對(duì)陸川豬優(yōu)質(zhì)肉質(zhì)性狀的形成造成影響，其潛在的機(jī)制需要進(jìn)一步探討。用生物軟件分析陸川豬與烏金豬、牛、人、綿羊、蘇門答臘猩猩、山羊這幾個(gè)物種的FTO基因CDS的同源性，發(fā)現(xiàn)同源性達(dá)到86.7%以上；同時(shí)構(gòu)建物種系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，陸川豬與烏金豬遺傳距離最近，它們聚為同一支。對(duì)陸川豬FTO氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)，亮氨酸含量最高，占氨基酸總數(shù)的11.7%，F(xiàn)TO蛋白具有較強(qiáng)的親水性；對(duì)陸川豬FTO蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其包含α螺旋、無(wú)規(guī)卷曲和延伸鏈。

5結(jié)論

本試驗(yàn)成功克隆了陸川豬FTO基因的CDS序列，其突變位點(diǎn)可能影響陸川豬肌內(nèi)脂肪沉積，進(jìn)而影響肉質(zhì)，今后對(duì)陸川豬脂肪沉積進(jìn)行研究時(shí)可以FTO基因?yàn)橹饕蜻x基因之一，本試驗(yàn)為深入揭示FTO基因在陸川豬脂肪沉積和脂肪代謝中的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。

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作者：夏琴；吳永文；瞿秋紅；崔悅悅；鄒輝；蔣欽楊；黃艷娜 單位：廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院