陸川豬FTO基因的克隆及生物信息學探討范文

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摘要：為了獲得廣西陸川豬肥胖相關基因(fto)編碼區序列(CDS)，試驗利用基因克隆技術，從陸川豬背最長肌組織中提取總RNA，擴增出FTO基因CDS，并運用Lasergene7.0、ExpasyProtaram、ExpasyProtscale、NPS@在線蛋白分析系統和SWISS-MODEL在線分析預測系統等分析軟件對擴增出的序列進行生物信息學分析。結果表明：通過克隆測序得到的陸川豬FTO基因CDS全長為1518bp，與GenBank中公布的烏金豬FTO基因CDS的同源性為99.9%，與蘇鐘豬FTO基因CDS的同源性為99.6%；陸川豬存在第1050位點的C→G，堿基G為陸川豬所特有，導致天冬氨酸突變為谷氨酸；通過建立系統進化樹發現，陸川豬與烏金豬的遺傳距離最近，它們聚為同一支；陸川豬FTO氨基酸組成中亮氨酸含量最高，占氨基酸總數的11.7%，FTO蛋白具有較強的親水性；陸川豬FTO蛋白的二級結構包含α螺旋、無規則卷曲和延伸鏈。說明陸川豬FTO基因具有高度的保守性，今后在陸川豬脂肪沉積的研究中，FTO基因可作為主要候選基因之一。

關鍵詞：陸川豬；FTO；基因；克隆；軟件；生物信息學分析

肥胖相關基因（fatmassandobesityassociatedgene,FTO）是第一個被發現與一般人群肥胖有關系的可靠候選基因，近年來因其可調節脂肪細胞沉積，進而調控肥胖發生而廣受人們的關注[1]。JFischer等[2]研究發現，敲除小鼠的FTO基因后，突變后的小鼠不再肥胖，而缺失FTO基因會導致剛出生的小鼠發育比較緩慢、脂肪組織和去脂體重顯著減少，從而減少肥胖的發生。研究發現，FTO基因在調節能量平衡、新陳代謝、食欲、去甲基化等方面具有非常重要的作用[3-5]。目前，人、山羊、牛等物種的FTO基因序列已在GenBank上公布。關于FTO基因在豬上的研究也有一些報道，如Z.Q.Du等[6]研究發現，豬的FTO基因定位在6號染色體上；如黃英等[7]以烏金豬的脂肪組織作為模板，成功克隆得到FTO基因序列；付言峰等[8]成功克隆得到蘇鐘豬的FTO基因。然而到目前為止還未見關于廣西地方優良品種陸川豬FTO基因編碼區序列（CDS）的克隆及生物信息學分析的報道。本試驗采用基因克隆技術，從陸川豬背最長肌組織中克隆FTO基因，并運用生物軟件對該基因的序列進行生物信息學分析，旨在為弄清陸川豬FTO基因表達與脂肪沉積的相關性奠定基礎。

1材料

1.1試驗動物

陸川豬,由廣西畜牧所提供，屠宰后采集陸川豬的背最長肌組織，裝入滅菌消毒的凍存管中,立即置液氮中冷凍，迅速轉入-80℃冰箱中保存，備用。

1.2主要試劑

RNAisoPlus、反轉錄試劑盒，均由TaKaRa公司生產；膠回收試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司生產；大腸桿菌DH5α感受態細胞，南京諾唯贊生物科技有限公司生產；DL-2000Marker，廣州東盛生物科技有限公司生產；2×TaqMasterMis，康為世紀生物科技有限公司生產。

2方法

2.1陸川豬背最長肌組織總RNA的提取及反轉錄

剪取約100mg組織樣品置預冷過的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀后轉入1.5mLEP管中，加入RNAisoPlus1mL，之后按照反轉錄試劑盒說明書提取RNA，以總RNA為模板進行反轉錄。反轉錄體系（總體積為20μL）：OligodTPrimer1μL，10mmol/LdNTPMixture1μL，模板RNA2μL，5×PrimeScriptⅡBuffer4μL，RNase抑制劑0.5μL，PrimeScriptⅡRtase1μL，無RNA酶水10.5μL。反轉錄程序：42℃30s；95℃5s；5℃5s。

2.2引物的設計

參照參考文獻[錯誤!未定義書簽。]設計FTO基因引物序列，并由深圳華大基因科技有限公司合成。引物序列：FTO-F5′-ATGAAGCGAACCCCAACC-3′和FTO-R5′-CTAGGGTTTGGCTTCCAG-3′，預計FTO基因的擴增片段大小為1518bp。

2.3FTOcDNA的克隆

反應體系（總體積為15μL）：2×TaqMasterMix7.5μL，上、下游引物各0.5μL，cDNA1μL，無RNA酶水5.5μL。反應程序：95℃預變性5min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環；最后72℃再延伸5min。取PCR產物6μL，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色后c用紫外凝膠成像儀觀察并拍照。按照膠回收試劑盒說明書回收純化FTO基因目的片段，將目的片段與pMD18-T克隆載體連接過夜；次日將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，用菌液涂布LB平板，次日挑選陽性克隆至含氨芐西林的LB液體培養基中。取含有目的片段的重組菌液，送至深圳華大基因科技有限公司測序。

2.4陸川豬FTO基因與同物種間的序列比對

利用Lasergene7.0生物分析軟件對陸川豬FTO基因CDS與同物種間FTO基因CDS進行同源性及氨基酸突變分析。

2.5陸川豬FTO基因同源性比較及系統進化樹構建利用

Lasergene7.0生物分析軟件中MegAlign程序對測序得到的陸川豬FTO與其他物種FTO基因CDS進行同源性分析并構建系統進化樹。

2.6陸川豬FTO氨基酸組成分析

利用NCBI在線預測軟件ORFFinder將測序得到的FTO核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，然后利用ExpasyProtaram在線分析系統對陸川豬FTO的氨基酸序列進行分析。

2.7陸川豬FTO親疏水性分析

利用ExpasyProtscale在線分析系統對陸川豬FTO的親疏水性進行分析。2.8陸川豬FTO基因二級、三級結構的預測分別利用NPS@在線蛋白分析系統和SWISS-MODEL在線分析預測系統預測和分析陸川豬FTO蛋白的二級、三級結構。

3結果與分析

3.1陸川豬FTO基因CDS的PCR擴增

采用RT-PCR方法成功克隆得到陸川豬FTO基因，其PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果條帶位置與預期序列長度1518bp一致，見圖1，因此可以初步確定此條帶為陸川豬FTO基因CDS。經深圳華大基因科技有限公司測序發現，獲得了陸川豬FTO基因CDS，其長度為1518bp。

3.2陸川豬FTO基因與同物種間的序列比對

通過克隆得到的陸川豬FTO基因CDS與GenBank中公布的豬FTO基因(NM_001112692)CDS的同源性為99.5%；用陸川豬FTO基因CDS與NCBI中發表的烏金豬(JQ031263)和蘇鐘豬(JX873956)這兩種豬的FTO基因CDS進行對比，同源性分別為99.9%和99.6%，證實所克隆的片段為陸川豬FTO基因CDS序列。陸川豬FTO基因CDS與其他豬相比，存在第1050位點的C→G，堿基G為陸川豬所特有，導致天冬氨酸突變為谷氨酸。此外，與GenBank中公布的豬FTO基因(NM_001112692)相比，陸川豬FTO基因CDS第38位點的G→A，導致甘氨酸突變為谷氨酸，第509位點的C→T，導致丙氨酸突變為纈氨酸，第614位點的G→A，導致絲氨酸突變為天冬酰胺，第796位點的A→G，導致天冬酰胺突變為天冬氨酸，第988位點的G→A，導致丙氨酸突變為蘇氨酸；第213位點的A→G，第594位點的C→G，但均為同義突變。與GenBank中公布的蘇鐘豬(JX873956)相比，陸川豬FTO基因CDS第614位點的G→A，導致絲氨酸突變為天冬酰胺，第1330位點的G→A，導致丙氨酸突變為蘇氨酸；第213位點的A→G，第594位點C→G，但均為同義突變。與GenBank中公布的烏金豬(JQ031263)相比，陸川豬FTO基因CDS第163位點的T→G，導致半胱氨酸突變為甘氨酸。

3.3陸川豬FTO基因同源性比較及系統進化樹構建

利用Lasergene7.0生物分析軟件中的MegAlign程序對測序得到的陸川豬FTO基因編碼區序列與NCBI中的烏金豬(JQ031263)、牛(BC140478)、人(NM_001080432)、綿羊(EU072419.1)、蘇門答臘猩猩(NM_001132778)、山羊(NM_001319276)的FTO基因編碼區序列進行同源性比較，結果同源性分別為99.9%、87.9%、87.3%、87%、86.8%和86.7%。

3.4陸川豬FTO氨基酸組成分析

利用ExpasyProtaram在線分析系統分析陸川豬FTO的氨基酸序列，推測出陸川豬FTO蛋白分子質量為58132.05u，等電點為5.19。

3.5陸川豬FTO蛋白的親疏水性分析

借助ExpasyProtscale在線分析系統預測FTO的親疏水性，其中正數表示疏水，數值越大表示疏水性越強；而負數表示親水，數值越小表示親水性越強。

4討論與結論

近年來，FTO基因可通過調控機體攝食和脂肪代謝影響肥胖而廣受學者的關注[9]。在動物營養與肉質調控領域中，FTO基因在影響動物肉品質的關鍵因素——脂肪沉積和代謝方面的研究也取得了一定進展。林亞秋等[10]克隆出簡州大耳羊FTO基因，并發現24月齡山羊股二頭肌和背最長肌FTO基因表達量要比8~10月齡、1~3月齡高，背最長肌FTO基因表達量與其肌內脂肪（IMF）含量呈負相關，相關系數（r）等于-0.415。李倩等[11]研究發現，FTO基因在成都麻羊臂三頭肌中的表達量與IMF含量的相關系數是-0.821，呈高度負相關，說明在山羊肌內脂肪沉積中FTO基因很可能發揮了重要調控作用。林森等[12]克隆出藏雞FTO基因CDS，并發現藏雞不同發育階段不同肌肉組織中FTO基因表達水平與其IMF含量呈不同程度的相關。付言峰等[8]研究發現，FTO基因在蘇鐘豬不同組織中的表達量不同，從低到高的排序為背最長肌＜肝臟＜肺臟＜心臟＜背膘，這與M.B.Madsen等[13]以哥廷根小型豬作為試驗動物的研究結果一致。陳友貴等[14]研究發現，10月齡貴州白冼豬不同組織中FTO基因由小到大的順序是胃<肝臟<大腸<肌肉<肺臟<小腸<心臟<腎臟<脾臟。朱琳娜[15]研究發現，180日齡脂肪型豬種金華豬的肌肉和脂肪組織中FTO基因表達量要比同日齡瘦肉型長白豬和中間型長金豬高，此研究結果說明此基因與肥胖和機體能量代謝間的相關性較高。黃英等[7]研究發現，云南烏金豬脂肪和肌肉中均有FTO基因的表達，但肌肉中的表達量比脂肪低。本試驗克隆得到陸川豬FTO基因CDS，長度為1518bp，與GenBank中公布的中國云南地方脂肪型豬種烏金豬FTO基因CDS的同源性為99.9%，與江蘇自主培養雜交瘦肉型蘇鐘豬FTO基因CDS的同源性為99.6%。此外，陸川豬FTO基因CDS與其他豬相比，存在第1050位點的C→G，堿基G為陸川豬所特有，導致天冬氨酸突變為谷氨酸。研究發現，豬FTO基因定位在調控眾多脂肪性狀的數量性狀位點的6號染色體區域上[6，16]。故FTO基因的表達很可能與陸川豬的脂肪沉積和代謝存在密切關系，從而對陸川豬優質肉質性狀的形成造成影響，其潛在的機制需要進一步探討。用生物軟件分析陸川豬與烏金豬、牛、人、綿羊、蘇門答臘猩猩、山羊這幾個物種的FTO基因CDS的同源性，發現同源性達到86.7%以上；同時構建物種系統進化樹，結果表明，陸川豬與烏金豬遺傳距離最近，它們聚為同一支。對陸川豬FTO氨基酸組成分析發現，亮氨酸含量最高，占氨基酸總數的11.7%，FTO蛋白具有較強的親水性；對陸川豬FTO蛋白二級、三級結構進行預測，發現其包含α螺旋、無規卷曲和延伸鏈。

5結論

本試驗成功克隆了陸川豬FTO基因的CDS序列，其突變位點可能影響陸川豬肌內脂肪沉積，進而影響肉質，今后對陸川豬脂肪沉積進行研究時可以FTO基因為主要候選基因之一，本試驗為深入揭示FTO基因在陸川豬脂肪沉積和脂肪代謝中的調控作用奠定了基礎。

參考文獻：

[1]王輝,孟雁.肥胖基因FTO的研究進展[J].國際內分泌代謝雜志,2010,30(2):116-118.

[5]陳靜,孫琳.FTO基因rs9939609研究進展[J].中國醫藥導刊,2011,13(4):682-683.

[7]黃英,楊明華,畢保良,等.烏金豬FTO基因的克隆和表達分析[J].生物技術通訊,2014,25(3):316-322.

[8]付言峰,李蘭,王學敏,等.蘇鐘豬FTO基因的mRNA表達、克隆測序及其生物信息學分析[J].華北農學報,2013,28(1):128-134.

[10]林亞秋,廖紅海,賀慶華,等.山羊FTO基因克隆及其表達譜[J].畜牧獸醫學報,2016,47(5):888-898.

[11]李倩,林亞秋,廖紅海,等.成都麻羊FTO基因組織表達及其與IMF含量的相關性研究[J].黑龍江畜牧獸醫,2016(04上):97-99.

[12]林森,林亞秋,朱江江,等.藏雞FTO基因表達的時空特性及與肌內脂肪含量的相關分析[J].畜牧獸醫學報,2017,48(7):1191-1201.

[14]陳友貴,馮文武,龍威海,等.白洗豬不同組織FTO基因的表達研究[J].基因組學與應用生物學,2015,34(5):926-930.

[15]朱琳娜.FTO、METTL3基因表達對豬脂肪細胞mRNAN6-甲基腺苷水平及脂肪沉積的影響研究[D].杭州:浙江大學,2014.

作者：夏琴；吳永文；瞿秋紅；崔悅悅；鄒輝；蔣欽楊；黃艷娜 單位：廣西大學動物科學技術學院