甲羥戊酸對萜類物質(zhì)合成的影響范文

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《中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)》2014年第四期

1甲羥戊酸途徑

甲羥戊酸途徑是生物合成類異戊二烯物質(zhì)的經(jīng)典途徑［15，16］，Shiao通過同位素追蹤證實(shí)擔(dān)子菌中存在甲羥戊酸途徑，它主要在細(xì)胞質(zhì)和線粒體內(nèi)發(fā)生，以乙酰輔酶A為合成初始物。甲羥戊酸途徑（圖1）的主要過程就是乙酰輔酶A（乙酰CoA）在乙酰硫解酶的作用下發(fā)生克萊森縮合和裂解反應(yīng)，分別在乙酰CoA的C上縮合生成乙酰乙酰CoA；接著再與一分子乙酰CoA在3羥基3甲基戊二酸單酰輔酶A（HMGCoA）的催化，以及Fe2＋和質(zhì)體醌（quinone）的輔助下，由乙酰CoA酰基轉(zhuǎn)移酶發(fā)生不可逆反應(yīng)生成HMGCoA；HMGCoA通過HMGCoA還原酶催化接受NADPH的氫，經(jīng)兩步反應(yīng)生成甲羥戊酸；在此過程中HMGCoA還原酶是整個(gè)甲羥戊酸途徑的關(guān)鍵控制酶，接著便是甲羥戊酸在三個(gè)連續(xù)ATP依賴酶之一的甲羥戊酸激酶的作用下，生成甲羥戊酸5磷酸；然后生成物再在磷酸甲羥戊酸激酶的催化下生成甲羥戊酸5焦磷酸；之后在甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶的作用下發(fā)生脫羧反應(yīng)生成異戊烯焦磷酸，而異戊烯焦磷酸（isopentenypyrophosphate，IPP）和二甲烯丙基焦磷酸（dimethylallylpyrophosphate，DMAPP）是一些萜類、甾醇等類異戊二烯類前體物質(zhì)［18］。在甲羥戊酸途徑中，乙酰CoA是此途徑IPP合成的前體物質(zhì)，對于萜類物質(zhì)的產(chǎn)量有著重要的作用；而3羥基3甲基戊二酸單酰CoA（HMGCoA）是整個(gè)途徑的關(guān)鍵限速酶，甲羥戊酸激酶（MVK）則是三個(gè)ATP依賴酶的第一個(gè)，HMGCoA和MVK對于萜類物質(zhì)的合成起到限制和控制的作用。

2甲羥戊酸途徑物質(zhì)對萜類物質(zhì)合成的影響

2．1乙酰CoA對萜類化合物的影響在擔(dān)子菌經(jīng)由甲羥戊酸途徑合成萜類物質(zhì)中，乙酰CoA是整個(gè)途徑的起始物，其含量多少直接影響著整個(gè)途徑中萜類化合物的生成量。生物體內(nèi)的乙酰CoA主要是一些CoA在酶的作用下接受乙酰基催化生成的，雖然細(xì)胞質(zhì)內(nèi)乙酰CoA主要參與脂肪酸的合成，但胞質(zhì)乙酰CoA仍可以經(jīng)由甲羥戊酸途徑合成異戊二烯焦磷酸，并最終合成萜類化合物。在此合成萜類化合物的過程中，乙酰CoA在HMGCoA還原酶的作用下生成HMGCoA（圖2）。在萜類物質(zhì)合成的過程中，乙酰乙酰CoA硫解酶（乙酰CoA乙酰轉(zhuǎn)移酶）催化乙酰CoA合成HMGCoA，首先共價(jià)乙酰CoA與CoAS－反應(yīng)生成乙酰SCoA，隨后第二個(gè)乙酰CoA基質(zhì)上去質(zhì)子化的C2與乙酰乙酰CoA硫解酶上的負(fù)碳離子反應(yīng)，進(jìn)而生成乙酰乙酰CoA和CoASH；然后兩分子乙酰CoA在HMGCoA合成酶的作用下生成HMGCoA。乙酰CoA是甲羥戊酸途徑的前體物質(zhì)，因此對于合成萜類物質(zhì)的前體物質(zhì)起到總量控制的作用，改變乙酰CoA的濃度會(huì)直接影響萜類物質(zhì)的產(chǎn)量。最近幾年的研究證實(shí)，可以通過調(diào)控乙酰CoA的基因表達(dá)來增加乙酰CoA的含量，進(jìn)而增加萜類物質(zhì)在目標(biāo)載體中的產(chǎn)量。Shiba等在啤酒酵母中異源表達(dá)來自于沙門氏菌的乙酰CoA合成酶基因ACS，在啤酒酵母菌株P(guān)DB108中獲得高濃度的青藁素前體物amorphadiene，從而提高了萜類物質(zhì)青藁素的含量；歐陽翔在研究靈芝三萜類化合物時(shí)發(fā)現(xiàn)，在甲羥戊酸途徑中乙酰CoA合成HMGCoA的催化酶GlHMGS啟動(dòng)子中，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)潛在的茉莉酸響應(yīng)元件，并且參與了茉莉酸甲酯信號調(diào)控的靈芝三萜類生物合成途徑，同時(shí)猜測這種調(diào)控機(jī)制可能是潛在的茉莉酸甲酯響應(yīng)元件介導(dǎo)的。而且在萜類物質(zhì)合成的過程中，還可以通過乙酰CoA的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用來增加萜類物質(zhì)的產(chǎn)量。陳孚江等在研究酵母乙酰CoA合成基因ACS時(shí)，通過增加其胞內(nèi)乙酰CoA的含量來加大甲羥戊酸途徑碳代謝流量，從而達(dá)到增加類異戊二烯產(chǎn)物的合成；并且甲羥戊酸途徑中，乙酰CoA的水平受到中間關(guān)鍵物甲羥戊酸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)［22］。Asadollahi等通過刪除GDH2來弱化甲羥戊酸代謝途徑反饋抑制，從而增加了甲羥戊酸途徑的碳代謝流量，使得目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量提高。由于乙酰CoA在生物體內(nèi)同時(shí)參與許多重要的生化反應(yīng)，如三羧酸循環(huán)（tricarboxylicacidcycle，TCA）、脂肪酸合成與分解（fattyacidssynthesisanddegradation）和氨基酸代謝（aminoacidmetabolism）等，在這些途徑中可以通過控制甲羥戊酸途徑來促使乙酰CoA轉(zhuǎn)向不同的代謝途徑，從而有利于提高不同途徑產(chǎn)物的產(chǎn)量。魏萍等［24］在裂殖壺菌中通過增加乙酰CoA在甲羥戊酸途徑中的供應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二十二碳六烯酸（DHA）的產(chǎn)量比空白對照提高了46．61％。因此在擔(dān)子菌甲羥戊酸途徑中乙酰CoA不僅可以控制萜類物質(zhì)的合成及其含量，還可以通過調(diào)節(jié)乙酰CoA來調(diào)節(jié)擔(dān)子菌非甲羥戊酸途徑的代謝產(chǎn)物（圖3）。

2．2HMGCoA還原酶的限制在甲羥戊酸途徑中，3羥基3甲基戊二酸單酰CoA（3hydroxy3methylglutarylCoA，HMGR）是各種類異戊二烯物質(zhì)合成過程中很重要的關(guān)鍵限速酶，同時(shí)也是甲羥戊酸途徑中調(diào)控的重點(diǎn)，它在此途徑中能催化乙酰CoA合成甲羥戊酸，而后者在酶的進(jìn)一步作用下合成異戊二烯焦磷酸（IPP），進(jìn)而生成類萜類物質(zhì)的另一前體物二甲烯丙基焦磷酸（DMAPP）。生物界存在兩大類HMGCoA還原酶，動(dòng)物、植物、真菌等真核生物及部分古細(xì)菌，如詹氏甲烷球菌（Methanococcusjannaschii）、擔(dān)子菌的HMGCoA還原酶屬于I類還原酶，假單胞桿菌、肺炎鏈球菌、腸道球菌等原核生物及部分古細(xì)菌（Archaeoglobusfulgidus）的HMGCoA還原酶屬于Ⅱ類還原酶。擔(dān)子菌HMGCoA還原酶是由4個(gè)97ku的相同亞基組成的N甘露糖糖蛋白，其中每個(gè)亞基有888個(gè)氨基酸殘基組成，第872個(gè)氨基酸磷酸化［25］，其中HMGCoA催化還原為甲羥戊酸的過程中需要2分子的NADPH、2H＋以及HMGCoA還原酶，此過程包括3個(gè)連續(xù)的反應(yīng)階段，甲羥戊酸是第二個(gè)反應(yīng)階段的中間產(chǎn)物，并且HMGCoA還原酶還能催化該反應(yīng)的逆向反應(yīng)，氧化甲羥戊酸為HMGCoA［26］（圖4）。在萜類物質(zhì)的合成過程中，通過HMGCoA還原酶基因的過表達(dá)能夠增加萜類物質(zhì)的產(chǎn)量，現(xiàn)階段HMGCoA還原酶基因已經(jīng)能夠克隆和表達(dá)。Rico等在酵母中轉(zhuǎn)錄仙女扇沉香醇合酶基因（LIS），在菌株T73中LIS能夠解除HMGCoA還原酶對單萜沉香醇含量的抑制作用，并且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HMGCoA的過表達(dá)能夠少量的增加沉香醇的含量。Xu等通過運(yùn)用RTPCR方法來表達(dá)HMGCoA還原酶基因，驗(yàn)證了其在靈芝中其與三萜類物質(zhì)之間存在著重要相關(guān)性；隨后發(fā)現(xiàn)靈芝的同源轉(zhuǎn)錄能夠增加靈芝酸的基因表達(dá)水平；同時(shí)通過縮短HMGCoA還原酶基因，并在農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)錄過表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其能夠增加靈芝酸的含量，從而證明HMGCoA還原酶能夠增加靈芝中靈芝酸的含量，這也為研究者在提高靈芝酸含量方面提供了探索途徑。HMGCoA還原酶是萜類物質(zhì)合成的限速酶，在甲羥戊酸途徑中宏觀調(diào)控HMGCoA還原酶的活性主要是通過化學(xué)抑制劑，進(jìn)而降低酶的活性改變反應(yīng)速率，從而限制萜類物質(zhì)的合成。HMGCoA還原酶的化學(xué)抑制劑主要是他汀類化合物，阿托伐他汀類藥物通過氫鍵作用使其3，5二羥戊酸和蛋白質(zhì)殘基之間連接，而蘇伐他汀類藥物則除了存在氫鍵作用外，其上面的氧原子還能和蛋白質(zhì)殘基之間存在極性作用，從而使得這類藥物的抑制作用更顯著。他汀類抑制劑的結(jié)構(gòu)中側(cè)鏈部分與HMGCoA結(jié)構(gòu)相似，有些需要水解成β羥酸的活性產(chǎn)物而發(fā)揮作用，因抑制劑的開放酸部分可與HMGCoA還原酶活性部位相結(jié)合，因此競爭性抑制HMGCoA還原酶活性，從而阻斷HMGCoA轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢u戊酸。他汀類藥物中憎水性的剛性結(jié)構(gòu)上的β，δ二羥基酸鏈的鄰位引入憎水基團(tuán)能夠增強(qiáng)藥物與HMGR的結(jié)合，在剛性結(jié)構(gòu)的其他位置引入極性基團(tuán)能夠加強(qiáng)藥物對HMGR的抑制作用。但是甲羥戊酸能夠逆轉(zhuǎn)HMGCoA還原酶抑制劑產(chǎn)生的抑制作用。徐琳等研究表明甲羥戊酸能夠拮抗辛伐他汀對鼠血管成纖維細(xì)胞（VFs）膠原合成的抑制作用，陳永清等［33］發(fā)現(xiàn)左旋甲羥戊酸能夠逆轉(zhuǎn)辛伐他汀對心肌細(xì)胞肥大的抑制作用。

2．3甲羥戊酸激酶（MVK）的限制甲羥戊酸激酶（mevalonatekinase，MVK）是甲羥戊酸途徑合成萜類化合物的三個(gè)連續(xù)ATP依賴酶的第一個(gè)，其與ATPγ位上的磷酸基團(tuán)作用，把磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到甲羥戊酸C5上催化還原形成甲羥戊酸5磷酸，同時(shí)產(chǎn)生ADP。甲羥戊酸激酶能夠催化形成類異戊二烯衍生物；同時(shí)甲羥戊酸激酶能夠催化合成某些病原微生物的抑制物質(zhì)，因此利用酶來抑制微生物可能是未來開發(fā)致病微生物抑制劑的重要內(nèi)容，但在真菌中此方向的研究還很少，大部分集中在動(dòng)物和植物方面的研究。甲羥戊酸激酶是甲羥戊酸途徑的限速酶之一，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)在甲羥戊酸磷酸化的過程中，甲羥戊酸激酶能夠有序的對其反應(yīng)物起作用，首先當(dāng)所有的底物都與激酶結(jié)合后，才釋放出第一個(gè)產(chǎn)物，也就是甲羥戊酸激酶首先同底物中的甲羥戊酸結(jié)合，然后依次順序結(jié)合MgATP，而甲羥戊酸磷酸是第一個(gè)被釋放的產(chǎn)物，然后才是ADP的釋放，其反應(yīng)機(jī)制如圖5所示。甲羥戊酸激酶基因表達(dá)模式在植物中研究的比較多，在動(dòng)物和微生物中研究的比較少。通過MVK保守區(qū)域氨基酸序列的比較，發(fā)現(xiàn)真核生物和原核生物的甲羥戊酸激酶具有高度相似性，并進(jìn)一步分析其晶體結(jié)構(gòu)，表明所有生物MVK酶活性中心都具有3個(gè)保守區(qū)域，并且每個(gè)保守區(qū)域的功能相同，這說明真核和原核生物的MVK酶促反應(yīng)機(jī)制相似，其中保守區(qū)1與底物結(jié)合及催化反應(yīng)有關(guān)，而保守區(qū)2和保守區(qū)3則與ATP的結(jié)合及催化反應(yīng)有關(guān)。甲羥戊酸激酶基因在植物體內(nèi)的過量表達(dá)增加了類異戊二烯衍生物的含量。郭溆等利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測三七中MVK擴(kuò)增基因PnMVK1的組織表達(dá)特異性時(shí)，檢測到該基因在根中的表達(dá)量最高，并推測三七根部的三萜皂苷含量最為豐富，為此可以進(jìn)一步推測三七M(jìn)VK基因的過表達(dá)能夠增加三萜皂苷的豐度；Champenoy等在煙草中表達(dá)酵母MVK基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)MVK基因的過表達(dá)能夠使甲羥戊酸激酶活性顯著增加，并且使煙草中根尖等部位的細(xì)胞分裂素增加。甲羥戊酸激酶的活性大小對萜類物質(zhì)的合成速率具有重要的影響作用，并對萜類物質(zhì)的產(chǎn)量有重要影響。甲羥戊酸激酶受代謝產(chǎn)物的反饋抑制調(diào)節(jié)，其中萜類前體物質(zhì)櫳牛兒基焦磷酸（GPP）和法尼基焦磷酸（FPP）是研究最多的抑制劑，兩者在不同生物中能顯著改變酶的活性。Voynova等對比了人類和金黃色葡萄球菌中FPP和法尼基硫代焦磷酸（FSPP）對甲羥戊酸激酶的影響，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌FSP／FSPP中的C15鏈能反饋抑制甲羥戊酸激酶，而在動(dòng)物中其在C6C15鏈上能抑制甲羥戊酸激酶，并且都能夠顯著影響甲羥戊酸激酶的特征值Km，進(jìn)而改變酶的活性。除此之外Cho［37］研究表明甲羥戊酸二磷酸和蘇氨酸相互作用能通過甲羥戊酸來影響甲羥戊酸激酶的Km，在甲羥戊酸途徑中，甲羥戊酸磷酸鹽在部分雙底物反應(yīng)中能影響甲羥戊酸激酶，其一旦與甲羥戊酸結(jié)合，甲羥戊酸激酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生局部性的變化，其活性位點(diǎn)附近的側(cè)鏈重新定向，并且鏈環(huán)的變化導(dǎo)致結(jié)合的空間變緊。在形成三級結(jié)構(gòu)時(shí)，活性位點(diǎn)會(huì)變得更緊密，結(jié)合的甲羥戊酸和肽鏈會(huì)發(fā)生額外的相互作用，從而影響MVK的Km值，根據(jù)分子動(dòng)力學(xué)理論，通過Km的改變能夠?qū)γ富钚约胺磻?yīng)速率都會(huì)產(chǎn)生影響，進(jìn)而可以達(dá)到影響萜類物質(zhì)合成速率的目的。

3展望

擔(dān)子菌是一類種類繁多的真菌，越來越多的擔(dān)子菌萜類化合物被證明對人類生活有重要的影響。甲羥戊酸途徑中的某些物質(zhì)乙酰CoA、HMGCoA還原酶、MVK對擔(dān)子菌萜類化合物的水平起到調(diào)節(jié)作用，并且此途徑中的產(chǎn)物對生物體內(nèi)其他物質(zhì)也有著一定的控制作用。Yasmim等證實(shí)在煙曲霉中麥角甾醇和載鐵素合成之間的相關(guān)性是通過甲羥戊酸所控制的，因此可以猜想甲羥戊酸途徑能夠影響擔(dān)子菌中其他次生代謝產(chǎn)物的含量，這可能將作為生物代謝產(chǎn)量提高的一條途徑。但是否擔(dān)子菌中非甲羥戊酸途徑次生代謝產(chǎn)物能夠影響甲羥戊酸途經(jīng)，并且這些次生代謝產(chǎn)物與萜類物質(zhì)是否存在關(guān)系還有待于進(jìn)一步的研究。鑒于甲羥戊酸途徑能夠影響許多微生物的次生代謝產(chǎn)物含量，這些次生代謝產(chǎn)物很多可以作為人類某些疾病的特效藥物，同時(shí)這些物質(zhì)還可用于人類日常生活中，因此利用甲羥戊酸途徑來刺激某些微生物的次生代謝產(chǎn)物水平將會(huì)進(jìn)一步的被研究利用。同時(shí)在擔(dān)子菌甲羥戊酸途徑HMGCoA還原酶的控制中，大部分的研究集中在抑制劑他汀類化合物對其作用的影響，但研究表明他汀類藥物對人體肝膽有危害，擔(dān)子菌很容易因富集他汀類物質(zhì)而使得某些食用類擔(dān)子菌對人體健康產(chǎn)生危害。同時(shí)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)人工合成藥物面臨各種安全問題，因此尋求安全有效的生物活性藥物已成為人類的迫切需求，而擔(dān)子菌甲羥戊酸途徑產(chǎn)物萜類化合物中存在大量對人體有益的成分，因此擔(dān)子菌萜類活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)可以為新藥物的研發(fā)提供方向，同時(shí)還可以替代同是HMGCoA還原酶抑制劑的他汀類物質(zhì)來作為治療人類某些慢性疾病的新藥物。

作者：李亮尚曉冬譚琦單位：上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所國家食用菌工程技術(shù)研究中心農(nóng)業(yè)部應(yīng)用真菌資源與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海海洋大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院