黃花部綜合特征與繁育系統(tǒng)研究范文

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《西北植物學報》2016年第二期

摘要：

生殖隔離是物種分化與延續(xù)的基礎，地黃屬植物是否存在生殖隔離仍不清楚。通過實地觀測地黃屬5個物種（天目地黃、湖北地黃、裂葉地黃、地黃和茄葉地黃）自然種群的花部形態(tài)、開花動態(tài)、花蜜體積、花蜜的糖濃度及其日變化、雜交指數(shù)、花粉－胚珠比等指標，結合人工授粉套袋，對地黃屬植物的花部綜合特征和繁育系統(tǒng)進行研究。結果顯示：（1）地黃屬植物的花為兩性花，單花花期5～7d，種群花期40～60d；5種地黃在花序類型、花形態(tài)、花粉量、花粉－胚珠比等方面都存在差異，其中茄葉地黃的花粉完全敗育。（2）5種地黃屬植物的繁育系統(tǒng)屬于異交，部分自交親和，需要傳粉者，不具有無融合生殖特性，地黃與茄葉地黃存在強烈營養(yǎng)繁殖。（3）5種地黃屬植物的花朵基部有蜜腺可以產生糖濃度較高的花蜜，這也支持傳粉者的存在，但除地黃確定為蜜蜂傳粉外，其它地黃植物在野外并未觀測到有效的傳粉者，可能與地黃的散生特性、生境相互隔離以及傳粉觀測期氣象條件惡劣有關。研究認為，5種地黃屬植物較長的花期能有效彌補傳粉者訪問頻率低的不足；除遺傳屏障外，推測地黃屬5個物種花展示方式的差異可能吸引不同的傳粉者，加之地理、生態(tài)因素的作用導致了5種地黃屬植物繁育系統(tǒng)的分化。

關鍵詞：

開花特性；繁育系統(tǒng)；花粉－胚珠比；雜交指數(shù)

地黃屬（Rehmannia）是東亞分布物種，隸屬玄參科。該屬植物現(xiàn)有5種：天目地黃、裂葉地黃、湖北地黃、地黃和茄葉地黃，為多年生草本，具根莖，總狀花序，花萼鐘狀，萼齒5枚，花冠呈管狀，分為5枚裂片（個別種內出現(xiàn)6裂片）。除茄葉地黃外其余4種地黃的雄蕊為4枚，茄葉地黃雄蕊多為6枚。種子多數(shù)，較小。地黃屬植物除地黃廣泛分布于華北外，其它4種分布較為局限：天目地黃分布于浙江、安徽的交界處，裂葉地黃、湖北地黃和茄葉地黃分布于秦巴山區(qū)。近年來對地黃屬的研究多偏重于地黃的藥性、化學成分及品種間遺傳基礎和系統(tǒng)發(fā)育關系等方面［3－6］，而對其繁育系統(tǒng)研究較少，僅有懷地黃的花粉形態(tài)［7］，地黃的繁育系統(tǒng)的研究［8］，其它4種的繁育系統(tǒng)研究未見報道。繁育系統(tǒng)的隔離是物種維持與分化的基礎，花作為被子植物的繁殖器官，其開放樣式和花部設計吸引不同的傳粉者［9］，再加上地理隔離、生態(tài)因素等可能導致不同物種繁育系統(tǒng)的分化。地黃屬不同種類是否存在物種特有的花部特征、傳粉昆蟲以及遺傳隔離機制等都是亟待解決的問題。本研究以5種地黃為研究對象，研究地黃屬植物自然居群的開花動態(tài)、花部形態(tài)、雜交指數(shù)、花粉－胚珠比、花蜜體積、花蜜的糖濃度，結合授粉和套袋的結果，揭示地黃屬植物的花部特征和開花規(guī)律，初步確定其繁育系統(tǒng)，判斷各種間是否存在遺傳隔離，為地黃屬植物生殖生物學以及物種形成和分化的深入研究奠定基礎。

1材料和方法

1．1研究地自然概況我們于2013年4～7月選擇5種地黃個體較多并且人為干擾較少的自然居群進行觀察，觀測地分別是：天目地黃———浙江省安吉縣（119．55°E，30．53°N），裂葉地黃———湖北省谷城縣（111．54°E，32．11°N），湖北地黃———湖北省興山縣（110．63°E，31．36°N），地黃———陜西省興平市（108．45°E，34．32°N），茄葉地黃———重慶市城口縣（108．80°E，31．73°N）。觀測后將這5個地點的5種地黃植株移栽于西北大學溫室，在相同的環(huán)境下培育，于2014年4～7月進行雜交實驗的研究。

1．2研究方法

1．2．1開花物候和花部特征的觀察在研究地點標記、觀測進入生殖生長期植株，每種地黃選擇10株，每株標記3朵花。觀察并記錄其開花進程，以及花被、花絲、花藥、子房的顏色、形狀并測量花萼長寬，花瓣長寬，花冠直徑，花冠管長度，花藥和花絲的長寬，子房和花柱的長寬，柱頭與花藥的空間距離［10－11］。同時我們在花冠的縱軸和橫軸測量花冠的張開度，用其比值表示花冠的圓度（比值為1∶1說明花冠張開度是圓形）。

1．2．2花粉敗育率的測定參考陳家瑞的孢粉染色法［12］。

1．2．3泌蜜動態(tài)測定選擇地黃屬植物盛花期，測量地黃屬植物的花蜜量和花蜜的糖濃度。選取5個植株，取每株植株上剛要開花的2朵花進行標記，然后套袋，對所有標記花的花蜜量進行測量，在8：00～18：00每隔2h用10μL的毛細管吸取花蜜1次；如果糖量足夠多，用手持糖量計折射儀測定花蜜的糖濃度。花蜜體積＝（毛細管中液柱長／毛細管總長）×毛細管的總體積［13］

1．2．4繁育系統(tǒng)類型的判斷（1）單花花粉量及P／O值的測定參考Dafni等［14］的方法，選取20朵始花期、未開裂的花測每朵花的花粉數(shù)。將每朵花的子房直接在載玻片上壓開，統(tǒng)計其胚珠數(shù)。P／O值＝單花花粉數(shù)／單花胚珠數(shù)（2）去雄－套袋－授粉實驗檢測繁育系統(tǒng)類型參考Dafni等［14］和Bowers［15］的描述方法，在實驗地選取位置相對一致的花，在花蕾期掛牌，分別進行套袋、去雄及人工授粉實驗，具體的處理參照劉林德等的方法［16］。（3）人工雜交實驗雜交授粉實驗于2015年4月1日～5月30日進行，選取種植于溫室的5種地黃進行正反交，每個品種選3～4株生長健康的植株作為母本。由于5種地黃的始花期時間不同，但是他們的花期有重疊，在花期重疊的時間內，將其它4種地黃的花粉用毛筆和鑷子涂抹到另外一種地黃的柱頭上進行人工授粉，授粉后套袋，待種子成熟后記錄結實情況，記錄種子萌發(fā)率。（4）OCI指數(shù)的估算按照Dafni的標準［17］進行花序直徑、花朵大小及開花行為的測量及繁育系統(tǒng)的評判。

1．2．5訪花昆蟲的調查在花期，隨機標記5株已開放的地黃屬植株，每株標記4個花，從日出到日落（約7：30～20：00）進行連續(xù)觀察記錄訪花昆蟲的種類并照相，捕捉訪花昆蟲，毒瓶殺死陰干，用于鑒定。

1．2．6數(shù)據(jù)分析方法用Statistica6．0處理數(shù)據(jù)，圖表在Origin9．0下完成。

2結果與分析

2．15種地黃的開花物候期和花部特征野外觀察發(fā)現(xiàn)5種地黃的開花時間不同，天目地黃于3月底開花，湖北地黃和地黃的開花時間在4月上旬，茄葉地黃于4月中旬開花，裂葉地黃的開花時間比其它4種地黃晚，于5月份開花。5種地黃的單花花期為5～7d，野外觀察5種地黃屬植物的花期顯示，茄葉地黃花期最短，為40d左右，地黃花期為50d左右，天目地黃、湖北地黃、裂葉地黃的花期都在60d左右。地黃屬植物花均為兩性的管狀花，花朵兩側對稱，花瓣上唇2枚下唇3枚。花蕾多在中午前后開放，大多數(shù)地黃的花在開花當天就產生花蜜，花開放時，柱頭明顯高于花藥的位置，花柱在花期內伸長不明顯，而花絲在開花當天或第2天開始伸長，直到花藥開裂花粉散出。地黃屬的花中除茄葉地黃為6個花絲外，其余地黃均為4個花絲，在這4個花絲中一般2枚較長的花絲先伸長且花藥開裂散粉，其余2枚滯后1～2d。花柱在花朵內部直立生長，花絲彎曲生長，花藥緊貼花管內部，花凋謝時花瓣和雄蕊一起脫落。5種地黃花朵的功能形態(tài)特征如表1所示，裂葉地黃的植株明顯高于其它4種地黃。地黃屬植物花朵開放時初始花蕾顏色為淡黃或者淡粉，等花朵開放，5種地黃的花瓣呈現(xiàn)不同的顏色，天目地黃的花瓣為紫紅色，裂葉地黃呈粉紅色，湖北地黃為白色，地黃呈淡黃色，茄葉地黃呈淡紫色。通過我們觀測發(fā)現(xiàn)雖然5種地黃的花均為管狀，但其花朵基部張開角度（花朵基部的張開角度是以花中花柱為中心軸，花冠底部與花柱所呈現(xiàn)的角度大小）卻不同，湖北地黃花朵基部的張開角度最大，且其花冠的圓度最接近1∶1。通過觀察花朵內部結構發(fā)現(xiàn)5種地黃中只有裂葉地黃的花藥位置比柱頭高，這樣的結構方便花粉自然落到柱頭上；5種地黃的柱頭形狀也有所不同，地黃和茄葉地黃的柱頭呈圓形，其它3種地黃的柱頭呈兩片狀。用孢粉染色法觀察5種地黃的花粉敗育，發(fā)現(xiàn)茄葉地黃的花粉敗育率為100％，裂葉地黃的花粉敗育率為76％，地黃的花粉敗育率為53％，天目地黃的花粉敗育率為39％，湖北地黃的花粉敗育率為38％。

2．2花蜜量的測定地黃屬植物的花在開放過程中分泌有花蜜，其蜜腺位于花冠筒和花柱基部，由于茄葉地黃觀測點環(huán)境惡劣，花朵受風雨打擊較大，花朵基部多存有雨水，因此沒有測其花蜜量。對4種地黃的花蜜量和糖濃度測定結果顯示，泌蜜量（圖1，A）和糖濃度（圖1，B）變化趨勢相似，從8：00時起逐漸升高，12：00時達到最高值，隨后逐漸下降。從圖1中我們可以看出湖北地黃和地黃的花蜜量最多，但是從測定的糖濃度看，地黃的花蜜糖濃度卻最低。2．3繁育系統(tǒng)觀測結果

2．3．1單花花粉量及花粉－胚珠比不同植物的花粉－胚珠比（P／O值）可以反映植物的不同繁育系統(tǒng)類型，根據(jù)CrudenP／O值和繁育系統(tǒng)的對應關系［18］，如表2所示，天目地黃的P／O值為220，湖北地黃的P／O值為252，介于31．9～396．0之間，繁育系統(tǒng)屬于兼性自交類型，裂葉地黃P／O值為456，地黃的P／O值為400，介于244．7～2588．0之間，繁育系統(tǒng)屬于兼性異交。由于茄葉地黃花粉完全敗育，故沒有測其P／O值。

2．3．2套袋－去雄－授粉的實驗結果（1）繁育系統(tǒng)檢測結果用不同的授粉處理進一步確定地黃屬植物的繁育系統(tǒng)類型。表3授粉結實數(shù)據(jù)表明，去雄套袋處理后，均未見結實，說明地黃屬植物不存在無融合生殖；天目地黃、湖北地黃和地黃的自花授粉不結實，而裂葉地黃自花授粉可以結實。自然條件下的傳粉和人工異株異花授粉的結實率較高，套紙袋與套網(wǎng)袋后結實率較低，表明套袋隔離訪花者后，傳粉成功率降低。（2）人工雜交實驗結果5種地黃雜交實驗結果如表4所示，茄葉地黃雜交均不結實，在其它雜交組合中除天目地黃與地黃的正交、地黃與裂葉地黃的正交無結實外其余組合均有結實。茄葉地黃花粉敗育故無法授粉給其它種地黃，然而我們將其它種地黃的花粉授予茄葉地黃時發(fā)現(xiàn)不結實。為了進一步驗證結實情況，我們種植雜交結實的種子，統(tǒng)計其出苗率，結果顯示：天目地黃×湖北地黃的正交和反交種子出苗率為100％；天目地黃×裂葉地黃的正交產生的種子出苗率為100％，反交產生的種子出苗率僅為15％；湖北地黃×裂葉地黃的正交產生的種子出苗率為100％，反交產生的種子出苗率為30％。

2．3．3OCI指數(shù)的估算按照Dafni方法［17］的測量結果如表5，地黃和茄葉地黃的花朵直徑雖然較其它3種地黃小，但是直徑均大于6mm，所以均記為3；5種地黃均為雄蕊先熟，所以記為1；而柱頭和花藥之間也均存在空間分隔，記為1。OCI的結果顯示5種地黃的繁育系統(tǒng)類型均為異交，部分自交親和，需要傳粉者。

2．4傳粉昆蟲對5種地黃的傳粉情況觀察表明，訪花昆蟲極少，在天目地黃花朵內觀察到薊馬，在湖北地黃中發(fā)現(xiàn)有寄生的蝸牛和蚊蠅類昆蟲，在裂葉地黃中觀察到蝴蝶停留在花朵上，這些昆蟲是否是有效傳粉昆蟲，有待于進一步確定。在地黃中發(fā)現(xiàn)蜂類吸取花蜜。這些昆蟲的訪花時間都較短，訪花時間集中在9：00～16：00，16：00過后訪花昆蟲活動減少。

3結論與討論

3．1地黃屬的開花特性本研究野外觀測到5種地黃的始花期有些差異，這可能與分布區(qū)的氣候條件和物種間差異有關，但當觀察移栽于同一地點的5種地黃，發(fā)現(xiàn)這5種地黃的始花期依然不同，說明地黃屬不同物種對光和環(huán)境的適應與調節(jié)機制不同，這些差異使得移栽于同一地點的不同物種的開花時間不同，開花時間上的不同以及地理隔離，阻止了不同物種之間的基因交流（花粉流），維持了物種的特異性和穩(wěn)定性。

3．2地黃的繁育系統(tǒng)據(jù)Danfi的標準［17］所得出的雜交指數(shù)表明，地黃屬植物的繁育系統(tǒng)為異交，部分自交親和，需要傳粉者。按照Cruden的花粉胚珠比（P／O）的標準［18］劃分，天目地黃和湖北地黃的繁育系統(tǒng)屬于兼性自交類型，裂葉地黃和地黃的繁育系統(tǒng)類型屬于兼性異交類型。套袋實驗結果顯示，地黃屬植物不存在無融合生殖，只有裂葉地黃自花授粉可以結實，自然條件下的傳粉和人工異株異花授粉的結實率相對較高。由此推測，該屬物種可能屬異花授粉。天目地黃和湖北地黃是姐妹類群［4］，它們的花部特征和繁育系統(tǒng)很相似，植株高度、柱頭形狀、花粉敗育率、P／O值等都沒有顯著差異。兩個物種最明顯的區(qū)別在于花朵顏色，天目地黃的花呈玫紅色，湖北地黃的花呈白色。野外觀察發(fā)現(xiàn)，湖北地黃和天目地黃的花藥均低于柱頭，如果不借助風媒和蟲媒傳粉，花粉很難到達柱頭，這種柱頭和花藥之間的隔離有利于異花授粉，而且雌雄蕊異熟也是它們不能自花授粉的一個重要原因。因此推測天目地黃和湖北地黃的繁育系統(tǒng)類型為異交，需要傳粉者。裂葉地黃的始花期較晚，花朵大，花期長，花朵顏色鮮艷，在裂葉地黃中發(fā)現(xiàn)其花絲長度高于花柱或者與花柱等高，這使得花粉很容易落在柱頭上，套袋－去雄－授粉的實驗結果也表明裂葉地黃自花授粉后會結實，這說明裂葉地黃自交親和，而異交的結實率更高。在氣候等條件不利時，裂葉地黃可以自交產生種子以繁殖后代。這種多樣的繁殖方式對裂葉地黃的繁殖和物種的延續(xù)都更有保障。地黃和茄葉地黃的花較其它幾種地黃花朵小，顏色不鮮艷。根據(jù)花部特征和對繁育系統(tǒng)的驗證，地黃屬于少部分自交親和，一般為異交，需要傳粉者。在野外我們也觀察到了蜜蜂對地黃花的訪問，這與張猛猛［8］的研究結果一致。茄葉地黃的花期最短，且花粉完全敗育，我們根據(jù)花部特征以及茄葉地黃的“成堆式”分布，推測茄葉地黃是用塊根進行營養(yǎng)繁殖。地黃也存在營養(yǎng)繁殖現(xiàn)象［19］。地黃屬植物的花粉數(shù)均顯著多于胚珠數(shù)，但是其花粉敗育率也高，以及雌雄蕊異熟，使得自交結實成功的概率并不大。植物自交產生的后代一般對環(huán)境的抵抗力差，但是在缺乏異交的條件以及環(huán)境的壓力下，逐漸形成了異交為主、自交為輔的方式，自交親和降低了生殖失敗的風險，保障了后代的延續(xù)和物種的存活。

3．3傳粉者的推測對于自交不親和的植物而言，傳粉者對于植物繁殖的重要性不言而喻。花朵通過鮮艷的顏色、便于傳粉者停留的花部結構以及提供花蜜花粉等報酬吸引不同的傳粉昆蟲，增加傳粉機會進而提高傳粉成功的概率，為植物后代的繁衍和物種的延續(xù)奠定基礎。5種地黃的花顏色多樣，不同顏色的花以及不同的花香會吸引不同類型的傳粉昆蟲［20］。花特征的演變與傳粉者之間的變化有很大關系，尤其是花管長度的變化［21－22］，地黃屬植物花冠管的基部會產生糖濃度很高的花蜜，傳粉者或者采蜜的昆蟲想要食得花蜜必須有和管狀花相適應的長舌結構等，然而野外實驗并未觀察到多種類的昆蟲訪問，這可能和觀測期當?shù)亻L期陰雨的天氣相關，也可能是授粉昆蟲沒有與花部特征相適應的結構，吸吮不到管狀花的花蜜，久而久之采蜜和授粉的昆蟲轉為其他更容易獲得傳粉報酬的植物傳粉。在野外觀察發(fā)現(xiàn)地黃屬的5個物種并沒有重疊分布，各自占據(jù)不同的生態(tài)位，再結合花部特征分析，推測地黃屬的植物可能吸引的是不同的傳粉者。

3．4地黃繁殖隔離的因素分析繁殖隔離是物種形成和分化的基礎，對于異域分布物種地理隔離減弱或者阻止了基因流，逐漸形成生殖隔離［23］。而同域分布的植物多以物候隔離作為生殖隔離的主要機制［24－26］。5種地黃中，地黃和茄葉地黃是四倍體物種，其它地黃屬于二倍體［4］，倍性差異導致的生殖屏障是繁殖隔離的關鍵因素。湖北地黃和裂葉地黃分布于秦巴山區(qū)，屬于同域分布物種，但二者開花時間分別為4月上旬和5月份，花期為60d，雖然花期有重疊，但沒有相同的傳粉昆蟲在他們之間充當基因交流的橋梁，使得它們之間的基因交流不能正常進行，而花色不同導致的傳粉者差異可能加劇了物種合子前隔離。天目地黃分布于華東地區(qū)，與湖北地黃的華中分布不同，地理隔離是基因交流主要障礙。人工雜交的實驗結果，也驗證了這一點：二倍體的天目地黃、湖北地黃和裂葉地黃之間并沒有遺傳上的生殖屏障，只是地理和生態(tài)隔離使得它們之間不能進行基因交流。對于同是四倍體的地黃和茄葉地黃而言，茄葉地黃分布區(qū)較地黃偏南，而且海拔更高（1200mvs400m），地理和生態(tài)隔離可能同時起到重要作用，而地黃和茄葉地黃的雜交并不結實，這說明四倍體的地黃和茄葉地黃可能在遺傳機制上有所差別導致生殖隔離。綜合上述分析，我們認為多種因素導致的生殖隔離是自然條件下地黃屬物種穩(wěn)定與維系的關鍵。需要指出的是，地黃屬植物均為異交為主的繁育系統(tǒng)，地理、生態(tài)或者遺傳因素究竟對種間生殖隔離的影響程度如何，仍需要進一步研究。

作者：程永琴 趙建花 韓凱 曾淑云 黃靜 劉占林 單位：西北大學 生命科學學院，西部資源生物與現(xiàn)代生物技術教育部重點實驗室